Rahul Katharia

Departamentul de Medicină Transfuzională, Institutul Postuniversitar de Științe Medicale Sanjay Gandhi, Lucknow, Uttar Pradesh, India

Rajendra K. Chaudhary

Departamentul de Medicină Transfuzională, Institutul Postuniversitar de Științe Medicale Sanjay Gandhi, Lucknow, Uttar Pradesh, India

Abstract

Fundal:

Testul antiglobulinic direct (DAT) este cel mai frecvent test efectuat în laboratorul de imunohematologie, care detectează imunoglobulina și fragmentele de complement atașate la celulele roșii din sânge. Aceste celule roșii din sânge acoperite sunt dificil de fenotipat cu precizie, ceea ce poate fi necesar pentru selectarea unității adecvate de celule roșii din sânge pentru transfuzie.

Am studiat eficacitatea diferitelor metode de eluare în îndepărtarea anticorpilor care acoperă celulele roșii și impactul acestora asupra activității diferite a antigenului grupelor sanguine.

Materiale și metode:

Probele de pacienți trimise pentru evaluarea serologică a hemolizei autoimune au fost incluse în studiu. Testul DAT și testul antiglobulinei indirecte (IAT) au fost efectuate folosind carduri de gel (sistem de identificare, DiaMed Elveția). Celulele roșii acoperite cu anticorpi, fie prin sensibilizare in-vivo sau in-vitro, au fost utilizate pentru a evalua rezultatul a trei metode de eluare.

Rezultate:

Din 93 de probe DAT pozitive deja sensibilizate in vivo, 28 de probe (30%) au devenit DAT negative posteluare folosind oricare dintre cele trei metode, în timp ce 36 (38,8%) au arătat reducerea puterii reacției, în timp ce în 29 (31,2%) a existat nici o schimbare a puterii reacției. În mod similar, din cele 17 eșantioane preparate prin sensibilizare in vitro, 12 eșantioane au devenit complet negative după eluarea glicinei-HCl/EDTA, 9 și 5 eșantioane au devenit negative după eluarea la căldură și respectiv a metodelor de eluare a difosfatului de clorochină, respectiv.

Concluzie:

La analiza comparativă, metoda de eluare a glicinei-HCl/EDTA a fost mai bună decât celelalte două metode și poate fi utilizată pentru eluarea imunoglobulinelor din celulele roșii intacte.

Introducere

Testul antiglobulinic direct (DAT) este cel mai frecvent test efectuat în laboratorul de imunohematologie, care detectează imunoglobulina și fragmentele de complement atașate la celulele roșii din sânge. Se efectuează de obicei pentru evaluarea pacienților cu suspiciune de hemoliză și un rezultat pozitiv semnifică acoperirea in vivo a celulelor roșii din sânge. Celulele roșii pot fi acoperite cu IgG sau complement singure sau cu o combinație. [1] Aceste celule roșii acoperite sunt dificil de fenotipat cu precizie, ceea ce poate fi necesar pentru selectarea unei unități de sânge adecvate pentru transfuzie la acești pacienți. [2]

Antiserurile reactive saline, antiserurile modificate chimic și anticorpii monoclonali IgM sunt disponibili pentru unii dintre antigenii eritrocitari, dar; antigenele detectate prin testul antiglobulinei indirecte sunt dificil de fenotipat. [3] Prin urmare, este necesar să se îndepărteze anticorpii din celulele roșii sensibilizate in vivo pentru a le fenotipa. Diferite proceduri de eluție sunt utilizate pentru disocierea anticorpilor de celule roșii. Multe dintre procedurile de eluție fie determină hemoliza totală a celulelor roșii, așa cum se vede cu metode de eluare cu eter cloroform sau xilen, sau provoacă denaturarea Kell; Antigeni Duffy și MNS, așa cum se observă cu ZZAP (ditiotreitol și papaină). [4,5]

Am studiat eficacitatea diferitelor metode de eluare în îndepărtarea anticorpilor care acoperă celulele roșii și impactul acestora asupra activității diferite a antigenului grupelor sanguine.

Materiale și metode

Probele de pacienți trimise pentru evaluarea serologică a hemolizei autoimune au fost incluse în studiu. DAT și IAT au fost efectuate folosind carduri de gel (sistem de identificare, DiaMed Elveția). Celulele roșii acoperite cu anticorpi, fie prin sensibilizare in-vivo sau in-vitro, au fost utilizate pentru a evalua rezultatul a trei metode de eluare.

S-au efectuat metode de eluție cu glicină-HCI/EDTA, eluție termică și clorochină difosfat pe toate probele DAT pozitive și a fost comparată eficacitatea lor în îndepărtarea autoanticorpilor.

Sensibilizarea celulelor roșii

Probele de celule roșii sensibilizate in vivo au fost obținute de la pacienți cu autoanticorpi reactivi calzi în serurile lor. Celulele roșii au fost spălate de șase ori cu ser fiziologic normal înainte de eluare. Supernatantul ultimei spălări a fost păstrat și utilizat ca martor negativ. Un total de 93 de probe care au fost pozitive prin carduri de gel (AHG polispecific), au fost supuse la trei metode de eluare.

Pentru sensibilizarea in vitro, globulele roșii grupate O obținute de la donatori sănătoși au fost incubate cu serurile corespunzătoare. Sere care conțin aloanticorpi (Anti D: 7, Anti D + C: 3, Anti E: 2, Anti Jka: 2, Anti M: 2, Anti Fya: 1) au fost obținute de la pacienți aloimunizați. Toți aloanticorpii utilizați pentru sensibilizarea in vitro au fost semnificativi clinic și au fost de tip IgG. Metoda de diluare a dublării a fost utilizată pentru a dilua anticorpii în seruri pentru a obține un DAT cât mai puternic posibil fără a provoca aglutinarea eritrocitelor. Un volum de ser diluat a fost incubat cu un volum de celule roșii ambalate spălate timp de 45 de minute la 37 ° C. Celulele roșii sensibilizate au fost spălate de șase ori cu soluție salină normală și apoi au fost testate cu card de gel.

Testarea directă a antiglobulinei

DAT a fost realizat prin tehnica de gel folosind carduri de gel disponibile în comerț (sistemul de identificare DiaMed, Elveția) care conțin reactiv antiglobulină poli specific. [6] Reacția de aglutinare a fost clasificată în conformitate cu instrucțiunile producătorului de la ± la 4+. Scorurile au fost determinate după cum urmează: ± (discutabil) = 1; 1+ (slab) = 3; 2+ (moderat) = 6; 3+ (puternic) = 9; 4+ (foarte puternic) = 12. [7]

Metode de eluare

Au fost utilizate următoarele metode de eluare: eluție glicină-HCI/EDTA, eluare la căldură la 56 ° C timp de 10 minute și disociere cu clorochină difosfat. [8-10]

EDTA (10%) a fost preparat prin adăugarea a 10gm de Na2EDTA (produse chimice fine Qualigens, Pvt Ltd, India) la 100 ml apă distilată. Glicina-HCI (0,1 M la pH 1,5) a fost preparată prin adăugarea de 0,75 g glicină (laboratoarele de cercetare Sisco Pvt Ltd, India) la 100 mL 0,9% NaCl (Qualigens, produse chimice fine, Pvt Ltd, India) și pH-ul a fost ajustat la 1,5 cu HCI concentrat (produs chimic fin Qualigens, Pvt Ltd, India). Soluția de glicină-HCI/EDTA a fost preparată amestecând 4 volume de tampon glicină-HCI 0,1 M (pH 2,0) cu 1 volum de 10% dihidrat disodic EDTA.

1M Tris-NaCI a fost preparat prin dizolvarea a 12,1 g de Tris (hidroximetil) amino metan (S.D. substanțe chimice fine Pvt Ltd, India) și 5,25 g de clorură de sodiu în 100 ml apă distilată. Procedura de eluare a fost efectuată prin amestecarea temeinică a 1 volum de soluție de glicină-HCI/EDTA proaspăt preparată cu volum egal de suspensie de 50% de celule roșii sensibilizate. După 2 minute, s-a adăugat un volum de Tris-NaCI 1M în tubul care conține suspensia celulară. Tubul a fost centrifugat la 3000 rpm timp de 1 minut. Celulele roșii obținute au fost spălate de trei ori în soluție salină normală. DAT a fost efectuat pe celulele tratate pentru a verifica rezultatul.

Soluția de difosfat de clorochină a fost preparată prin dizolvarea a 20 g de difosfat de clorochină (Sigma Chemical Co., St. Louis) în 100 ml de soluție salină tampon de fosfat. PH-ul a fost ajustat la 5 utilizând NaOH 5 N. Un volum de celule roșii sensibilizate a fost amestecat cu patru volume de soluție de clorochină pentru disociere. O fracțiune de celule roșii din suspensie a fost îndepărtată după aproximativ 30 de minute și verificată pentru îndepărtarea anticorpilor. După 2 ore la temperatura camerei, celulele roșii au fost spălate de trei ori în ser fiziologic normal.

Eluarea căldurii a fost realizată prin amestecarea volumelor egale de 50% celule roșii sensibilizate și ser fiziologic normal conținând 6% albumină serică bovină (Tulip diagnostics Pvt Ltd, India). Suspensia a fost incubată timp de 10 minute la 56 ° C într-o baie de apă și imediat centrifugată timp de 1 minut la 3000 rpm. Celulele roșii obținute au fost spălate de trei ori și testate.

Efectul metodelor de eluție asupra activității antigenului eritrocitar

Celulele roșii proaspete neacoperite de la donatori sănătoși normali de sânge au fost fenotipate atât înainte, cât și după procedurile de eluare. Au fost utilizate antiseruri specifice disponibile în comerț pentru a tipa antigenele grupelor sanguine (DiaMed, Elveția). Au fost studiate douăzeci de probe de donatori pentru fiecare sistem de grupe sanguine.

analize statistice

Am analizat datele folosind software-ul statistic disponibil comercial (versiunea SPSS 13). Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD. Krushal-Willis a fost folosit pentru a testa între grupuri. Testul statistic utilizat în analiză a fost de două valori și valoarea p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă.

Rezultate

Reducerea puterii pozitivității DAT

Din 93 de probe DAT pozitive deja sensibilizate in vivo, 28 (30%) probe au devenit DAT negative posteluare folosind oricare dintre cele trei metode, în timp ce 36 (38,8%) au arătat reducerea puterii reacției, în timp ce în 29 (31,2%) nu a existat schimbarea puterii reacției.

tabelul 1

Scorul de aglutinare DAT înainte și după eluarea glicinei HCl/EDTA, eluarea căldurii și eluarea clorochinei celulelor DAT pozitive

îndepărtarea

În mod similar, din cele 17 eșantioane preparate prin sensibilizare in vitro, 12 eșantioane au devenit complet negative după eluarea glicinei HCI/EDTA, 9 și 5 eșantioane au devenit negative după eluarea căldurii și respectiv a metodelor de eluare a difosfatului de clorochină, respectiv.

masa 2

Efectul metodelor de eluție asupra globulelor roșii sensibilizate in vitro