• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: mkakoki @ med.unc.eduoliver_smithies @ med.unc.edu

Contribuție de Oliver Smithies, 15 februarie 2013 (trimis spre examinare 23 ianuarie 2013)

primar

Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Abstract

Factorul de creștere transformant β1 (TGFβ1), membrul prototip al superfamiliei TGFβ, este o citokină multifuncțională puternică cu efecte asupra unei game largi de procese biologice, inclusiv proliferarea celulară, apoptoza, suprimarea tumorii, senescența (1, 2), diferențierea (3), migrația (4), imunitatea (5), osteogeneza (6), adipogeneza (7) și vindecarea rănilor (8).

Dacă TGFβ1 joacă vreun rol în controlul tensiunii arteriale (TA) nu este încă demonstrat în mod clar. Au fost generați șoareci cărora le lipsește complet TGFβ1 (9, 10), dar moartea lor din cauza unei boli inflamatorii severe în jurul înțărcării exclude măsurători ale TA. Boala inflamatorie și moartea timpurie pot fi eludate dacă șoarecii nu au, de asemenea, celule funcționale T și B ca urmare a inactivării genei activatoare a recombinării, Rag1 (11). Din păcate, inactivarea Rag1, fie singură, fie împreună cu Tgfb1 inactiv, a perturbat sistemele de control BP (12). La om, alela 915C a unui polimorfism nucleotidic unic în TGFB1, care duce la prolină la reziduul 25 din secvența peptidică semnal, a fost asociată la o populație europeană cu un risc redus de hipertensiune arterială (13). Alela 897C a unui al doilea polimorfism, care duce la prolină la reziduul 10 din secvența peptidică semnal, a fost asociată într-o populație asiatică cu un risc crescut de hipertensiune arterială (14, 15), dar dacă modificările afectează în mod direct TA nu a fost determinat.

Aceste studii documentează efectele complexe asupra cardiovasculaturii care rezultă din modificările funcției TGFβ1. Cu toate acestea, nu apare nicio imagine clară a efectelor variațiilor moștenite care modifică pur și simplu nivelul bazal al expresiei TGFβ1 fără a modifica secvențele de aminoacizi ale polipeptidelor care rezultă. Acest tip de informații are o importanță deosebită atunci când secvențele de aminoacizi sunt la fel de conservate ca și cele ale polipeptidelor TGFβ1. Astfel, 111 din cele 112 reziduuri care cuprind produsul activ TGFβ1 sunt identice la șoarece și la om și întinderi mari în restul de 278 resturi ale precursorului TGFβ1 sunt, de asemenea, identice (16).

În consecință, am generat șoareci cu expresie Tgfb1 ~ 10%, 50%, 200% și 300% normală, care acoperă intervalul probabil în populația umană generală. Găsim că mai mulți parametri cunoscuți pentru a regla TA sau pentru a răspunde la modificările acesteia sunt afectați într-o manieră remarcabil de proporțională de aceste modificări ale expresiei Tgfb1, indicând că chiar și modificările moștenite modeste în expresia genei umane TGFB1 sunt susceptibile de a avea efecte cardiovasculare semnificative.

Rezultate

Generarea șoarecilor hipo/hipermorfi pentru TGFβ1.

Ca preliminar la utilizarea țintirii genetice pentru a genera șoareci care exprimă niveluri modificate de TGFβ1, am folosit mai întâi sistemul nostru publicat (17) pentru a compara efectele relative asupra stabilității ARNm a regiunii 3'-netraduse (UTR) a Tgfb1 comparativ cu un panou de alte 3'-UTR-uri. Acest test a indicat faptul că am putea obține niveluri informativ scăzute și ridicate de expresie a TGFβ1 utilizând direcționarea genelor pentru a înlocui 3'-UTR natural al Tgfb1 cu 3'-UTR instabil al oncogenului osteosarcom FBJ (Fos) sau cu 3 stabil. ′ -UTR din gena hormonului de creștere bovin (bGH) (Fig. S1 A - C).

Concluzionăm că cele patru tipuri de șoareci generate de procedura noastră de direcționare genică au o expresie a ARNm Tgfb1 de ~ 10%, 50%, 200% și 300% normală, care acoperă intervalul probabil să apară în populația umană generală.

Chimia sângelui și hematologia șoarecilor hipo/hipermorfi TGFβ1.

Glucoza plasmatică, insulina plasmatică, azotul ureei plasmatice, creatinina plasmatică, sodiul plasmatic, clorura plasmatică și osmolaritatea plasmatică (tabelele S1 și S2) nu s-au putut distinge de WT la toți șoarecii la vârsta de 12 săptămâni, cu excepția faptului că potasiul plasmatic al L/L șoarecii au fost semnificativ mai mici decât WT (4,9 ± 0,1 mEq/L și 5,7 ± 0,1 mEq/L; P pentru L/L vs. WT −4).

Hematocriții șoarecilor L/L, L/+, H/+ și H/H nu se disting de WT (Tabelele S1 și S2).

Funcția adrenocorticală la șoarecii hipo/hipermorfi TGFβ1.

Nivelurile de aldosteron plasmatic au crescut progresiv pe măsură ce expresia controlată genetic a Tgfb1 a scăzut, variind de la ~ 50% sub WT la șoareci H/H până la ~ 200% WT la șoareci L/L (Fig. 2A). Nivelurile de corticosteron plasmatic (Fig. 2B) au fost semnificativ mai mari decât în ​​mod normal la șoarecii L/L (329 ± 57 și 145 ± 23 ng/mL; P pentru L/L vs. WT † P †† P −4, ‡ P - 5 vs. WT. (A) Niveluri de aldosteron plasmatic. (B) Niveluri de corticosteron plasmatic. (C) Nivelurile de ARNm pentru enzime necesare pentru sinteza aldosteronului în glanda suprarenală. (D) Volumul plasmatic. BW, greutatea corporală.

Funcția suprarenocorticală la șoarecii TGFβ1 hipo/hipermorfi la vârsta de 12 săptămâni. * P † P †† P −4, ‡ P −5 vs. WT. (A) Nivelurile de aldosteron plasmatic. (B) Nivelurile de corticosteron plasmatic. (C) Nivelurile de ARNm pentru enzime necesare pentru sinteza aldosteronului în glanda suprarenală. (D) Volumul plasmatic. BW, greutate corporală.

Expresia mRNA suprarenală a celor două gene care determină enzimele mitocondriale implicate direct în sinteza corticosteronului și a produsului său aldosteron, 11 beta hidroxilază (Cyp11b1) și aldosteron sintază (Cyp11b2), s-au potrivit cu modificările progresive ale nivelurilor plasmatice de aldosteron (Fig. 2C ). Alte gene implicate în steroidogeneză, proteină de reglare acută steroidogenă (Star), hidroxi-delta-5-steroid dehidrogenază, 3 beta și steroid delta-izomerază 1 (Hsd3b1) și 21-hidroxilază (Cyp21a1), au avut o expresie crescută atunci când exprimarea Tgfb1 a fost sub normal, deși numai la nivelul suprarenalelor L/L a atins această semnificație (Fig. 2C).

Examinarea microscopică a suprarenalelor nu a arătat anomalii structurale, cum ar fi hiperplazia nodulară, la oricare dintre șoareci (Fig. S3), dar greutatea suprarenală normalizată la greutatea corporală a fost dublată la șoarecii L/L (0,155 ± 0,014% greutate corporală vs. 0,082 ± 0,007% greutate corporală; PL/L vs. WT L/L (n = 6): 64 ± 9%, P = 0,11] Aceste observații sugerează că cel mai probabil factor care determină modificările progresive ale volumului plasmatic este o schimbare în reabsorbția de sodiu cauzată de modificările progresive ale nivelurilor plasmatice de aldosteron rezultate din diferențele determinate genetic în expresia Tgfb1.

Presiunea arterială la șoarecii hipo/hipermorfi Tgfb1.

Șoarecii L/L au avut o tensiune arterială sistolică (sBP) semnificativ mai mare decât WT, indiferent dacă au fost studiați cu metoda coșului (138 ± 3 mmHg vs. 106 ± 3 mmHg; P −5) sau prin telemetrie (146 ± 3 mmHg vs. WT 120 ± 2 mmHg; P -5); pulsul șoarecilor L/L a fost substanțial mai mic decât WT prin ambele metode (prin telemetrie, 494 ± 16 bătăi/min față de 661 ± 15 bătăi/min; P ‡ P −5 vs. WT. (B) Frecvența cardiacă în cele cinci genotipuri de șoareci cu o metodă coș-manșetă. ‡ P −5. (C) Presiunea arterială sistolică (sBP), tensiunea arterială diastolică (dBP) și presiunea arterială medie (MAP) studiate cu telemetrie în cele cinci genotipuri ale șoareci. ‡ P −5 vs. WT. (D) Ritmul cardiac în cele cinci genotipuri de șoareci cu telemetrie. †† P −4 vs. WT.

Presiune arterială crescută și ritm cardiac scăzut la șoareci masculi L/L la vârsta de 12 săptămâni. (A) Tensiunea arterială sistolică (sBP) la șoareci L/L, L/+, WT, H/+ și H/H determinată cu o metodă cu manșetă. ‡ P −5 vs. WT. (B) Frecvența cardiacă la cele cinci genotipuri de șoareci cu metoda coșului. ‡ P −5. (C) Tensiunea arterială sistolică (sBP), tensiunea arterială diastolică (dBP) și presiunea arterială medie (MAP) studiate cu telemetrie în cele cinci genotipuri de șoareci. ‡ P −5 vs. WT. (D) Frecvența cardiacă la cele cinci genotipuri de șoareci cu telemetrie. †† P −4 vs. WT.

Modificări gradate ale sistemului renină-angiotensină în hipo/hipermorfe TGFβ1.

S-au produs modificări multiple în sistemul renină - angiotensină ca răspuns la modificările controlate genetic ale expresiei Tgfb1, toate în direcția în care s-ar aștepta să mențină tensiunea arterială normală în fața unor volume de sânge anormal de mici sau mari. Astfel, concentrația plasmatică a angiotensinei II a variat de la ± 30% normal la șoarecii L/L la ~ 200% normal la șoarecii H/H în corelație inversă cu volumele plasmatice (Fig. 4A). Nivelurile de renină plasmatică, nivelurile de ARNm Renin 1c (Ren1c) în rinichi, nivelurile de ARNm ale enzimei de conversie a angiotensinei (Ace) în plămâni și nivelurile de ARNm ale angiotensinogenului (Agt) în ficat, toate prezintă modificări similare, deși L/L și H/Șoarecii H au avut răspunsuri proporțional mai mari decât șoarecii L/+ și H/+ (Fig. 4 B și C).

Sistemul renină - angiotensină - aldosteron la șoareci masculi L/L, L/+, WT, H/+ și H/H la vârsta de 12 săptămâni. * P † P †† P −4 vs. WT. (A) Nivelurile de angiotensină II în plasmă. (B) Concentrația activă de renină în plasmă. (C) Nivelurile de mARN de țesut pentru componentele sistemului renină-angiotensină.

Oxidul nitric și celelalte sisteme de control al tensiunii arteriale în hipomorfii TGFβ1.

Deoarece studiile anterioare sugerează că atât TGFβ1, cât și aldosteronul afectează activitatea și/sau expresia oxidului nitric endotelial (NO) sintază (eNOS) (18, 19), hipertensiunea arterială la șoarecii L/L s-ar putea datora parțial unei scăderi a eNOS funcţie. Pentru a evalua această posibilitate, am măsurat conținutul de proteine ​​din sero1177 eNOS fosforilat în rinichi și am constatat că este mai mare la șoareci L/L decât în ​​WT (Fig. 5A), deși treonină495 eNOS fosforilat, eNOS total și eNOS mRNA nivelurile sunt comparabile între cele două genotipuri (Fig. 5 B, C și F). În mod similar, conținutul de proteine ​​al serinei 473-serin fosforilate/treonine kinazei Akt (Akt) este mai mare la șoarecii L/L decât la WT, deși conținutul Akt total este comparabil între cele două genotipuri (Fig. 5 D și E).

Sistem de oxid nitric (NO) la rinichi la șoareci masculi WT și L/L la vârsta de 12 săptămâni. * P † P -/NO3 -) niveluri (μmol/L).

Spre deosebire de o constatare anterioară conform căreia expresia nivelurilor induse de NOS și serice ale NO2 -/NO3 - (produsele finale ale metabolismului NO) sunt semnificativ crescute la șoarecii TGFβ1-nuli (20), nu am găsit diferențe semnificative între WT și L Șoarecii/L în acești parametri (Fig. 5 G și I), deși expresia renală a NOS neuronal a fost semnificativ scăzută la șoarecii L/L (Fig. 5H). Din aceste rezultate, concluzionăm că este puțin probabil ca sistemul NO să joace un rol cauzal în hipertensiunea arterială la șoarecii L/L.

În plus, parametrii activităților altor câteva sisteme legate de controlul TA nu au diferit la șoarecii L/L și WT, inclusiv metanefrina [WT (n = 6): 47,5 ± 5,5 pg/ml vs. L/L (n = 6): 38,6 ± 2,9 pg/mL, P = NS] și normetanefrină [WT (n = 6): 668 ± 87 pg/mL vs. L/L (n = 6): 792 ± 89 pg/mL, P = NS], indicatori ai activității adrenergice și triiodotironină [WT (n = 6): 0,97 ± 0,02 pg/mL vs. L/L (n = 6): 0,89 ± 0,07 pg/mL, P = NS] și tiroxină [WT (n = 6): 3,01 ± 0,13 pg/mL vs. L/L (n = 6): 2,65 ± 0,26 pg/mL, P = NS], indicatori ai activității tiroidiene.

Echilibrul de apă și electroliți la șoarecii hipo/hipermorfi TGFβ1.

Aportul de alimente normalizat în funcție de greutatea corporală nu a diferit în cele cinci genotipuri (Fig. 6A), dar aportul de apă al șoarecilor L/L a fost aproape de două ori normal (Fig. 6B). În schimb, volumul de urină și osmolaritatea la șoarecii L/L au fost mai mici de o cincime din normal (Fig. 6 C și G). Excreția lor zilnică de sodiu, potasiu și clorură a fost redusă în mod similar (Fig. 6 D - F), deși așa cum s-a descris mai sus, concentrațiile plasmatice de sodiu și clorură și osmolaritatea plasmatică au fost normale (tabelele S1 și S2).

Date de studiu metabolice la șoareci masculi L/L, L/+, WT, H/+ și H/H la vârsta de 12 săptămâni. BW, greutate corporală. * P † P +) și echilibrul electroliților în ciuda aportului crescut de apă și a pierderii considerabile de apă și electroliți prin mecanisme extrarenale.

Funcția renală la șoarecii hipo/hipermorfi TGFβ1.

Histologia renală la șoareci cu diferențe în expresia Tgfb1 nu a evidențiat diferențe semnificative față de WT (Fig. S7). De asemenea, ratele de filtrare glomerulară și concentrațiile plasmatice de azot ureic și creatinină nu au fost diferite de WT (Fig. S8 și Tabelele S1 și S2), indicând faptul că funcția renală la șoareci este normală la vârsta de 12 săptămâni, când efectele generale ale diferitelor niveluri de Tgfb1 sunt deja pe deplin dezvoltat.

Nivelurile de ARNm renal la șoarecii L/L ai genelor legate de apa tubulară și transportul de sodiu nu s-au putut distinge de WT (Fig. S9). Cu toate acestea, spre deosebire de această absență a diferențelor în expresia ARNm a genelor care codifică subunitățile α, β și γ ale Na + -K + ATPazei (NK; Fig. S9), activitatea NK în omogenatele de rinichi s-a dovedit că să fie semnificativ crescută la șoarecii L/L (de 2,7 ori normal la L/L vs. WT; P † P †† P + -K + ATPaza (NK) studiată prin conversia sensibilă la ouabain a ATP în fosfat anorganic.) Ser fosforilarea NKα1. (C) Abundența proteinei NKα1. (D) Activitate totală ENaC la șoareci WT și L/L tratați cu vehicul (Veh), spironolactonă (Spi; 50 mg/kg/d timp de 7 zile) și DOCA ( 120 mg/kg/d timp de 3 d). (E) ENaC probabilitate deschisă (Po). (F) Expresie funcțională ENaC (fN).

Funcția renală la șoarecii hipomorfi TGFβ1. * P † P †† P + -K + ATPaza (NK) studiată prin conversia sensibilă la ouabain a ATP în fosfat anorganic. (B) Ser fosforilarea NKα1. (C) Abundența proteinei NKα1. (D) Activitate ENaC totală la șoareci WT și L/L tratați cu vehicul (Veh), spironolactonă (Spi; 50 mg/kg/zi timp de 7 zile) și DOCA (120 mg/kg/zi timp de 3 zile). (E) ENaC probabilitate deschisă (Po). (F) Expresie funcțională ENaC (fN).

La fel, deși expresia ARNm la șoarecii L/L ai genelor Scnna, Scnnb și Scnng nu a diferit de WT, activitatea canalului de sodiu epitelial total (ENaC) s-a dovedit a fi semnificativ mai mare (2,0 ori WT) în L/L decât la șoareci WT datorită creșterii probabilității deschise ENaC (1,5 ori WT) și a expresiei funcționale ENaC (1,6 ori WT). Creșterea sistemică a mineralocorticoizilor prin injecție cu acetat de deoxicorticosteron (DOCA) a crescut activitatea ENaC de 1,9 ori în WT, dar nu a mai avut niciun efect stimulator la șoarecii L/L, indicând faptul că ENaC a fost aproape activat maxim (Fig. 7 G - J).

Concluzionăm că, deși cantitățile de proteine ​​NK și ENaC și ARNm-urile corespunzătoare nu sunt crescute la șoarecii L/L, reabsorbția tubulară de sodiu este crescută prin activarea supranormală a proteinelor.

Normalizarea farmacologică a hipertensiunii arteriale Tgfb1 10% hipomorfe.

Testele farmacologice au arătat că spironolactona (un antagonist al receptorilor mineralocorticoizi), la niveluri care nu au modificat semnificativ TA la șoarecii WT, au scăzut TA și volumul plasmatic și au crescut sodiul urinar al șoarecilor L/L la niveluri care nu se disting de WT 8 A - C, tabelul S3); a scăzut, de asemenea, activitatea totală ENaC atât la șoarecii L/L cât și la șoareci WT la ~ 35% din WT netratat și a eliminat diferența de activitate ENaC între L/L și WT (Fig. 7D). Amilorida (un inhibitor ENaC) a normalizat, de asemenea, TA, volumul plasmatic și sodiul urinar al șoarecilor L/L (Fig. 8 A - D). În schimb, aliskiren (un inhibitor al reninei), losartanul (un antagonist pentru receptorul de tip 1 al angiotensinei II), atunci când sunt administrați în doze care au redus semnificativ sBP de WT, nu au normalizat TA de șoareci L/L (Fig. 8A) . Furosemidul (un diuretic de buclă) a scăzut sBP-ul șoarecilor L/L și WT independent de genotip, în timp ce N ω -nitro- L-arginina metil ester (NAME; un inhibitor NOS) și-a crescut sBP, la fel, independent de genotip. (Fig. 8A, Tabelul S3).

Normalizarea farmacologică a hipertensiunii arteriale Tgfb1 10% hipomorfe. (A) Tensiunea arterială sistolică (sBP) cu o metodă de manșetă a cozii la șoareci WT (coloane albe) vechi de 12 săptămâni și L/L (coloane negre) vehicul administrat (Vehicul), aliskiren (Ali; 40 mg/kg/d ip), losartan (Los; 10 mg/kg/d ip), spironolactonă (Spi; 50 mg/kg/d ip), amiloridă (Ami; ​​3 mg/kg/d ip), furosemid (Blana; 40 mg/kg/d ip), sau ester metilic N-it-nitro- L-arginină (DENUMIRE; 30 mg/kg/d ip) timp de 2 săptămâni. * P † P †† P −4 vs. grupul tratat cu vehicul de același genotip. NS, nicio diferență semnificativă. (B) Volumul plasmatic la șoareci WT și L/L fără și cu spironolactonă sau amiloridă. (C) Excreția urinară de sodiu. BW, greutate corporală. Șoarecii PH/+ și Tgfb1 H/H) au fost generați pe fundalul genetic C57BL/6 prin obținerea descendenților de la șoarecii masculi Tgfb1 L/+ având un transoxen de cre recombinază indus de tamoxifen omogen în creștere (Jackson Laboratories) injectat tamoxifen (50 mg⋅kg −1 ⋅d −1 ip în ulei de susan timp de 5 d). Efectele spironolactonei (50 mg⋅kg −1 ⋅d −1 ip pentru 4 săptămâni) și ale amiloridei (3 mg⋅kg −1 ⋅d −1 ip pentru 4 săptămâni) la șoarecii Tgfb1 L/L în vârstă de 12 săptămâni au fost de asemenea studiat.

Experimentele noastre au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Carolina de Nord.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de National Institutes of Health Grants HL49277, HL70523, HL71266, DK20593, DK59637, DK056350 și DK34987; o subvenție de la American Heart Association (SDG2230391); o subvenție din partea Fundației suedeze pentru inimă și plămâni; o subvenție din partea Consiliului Suedez pentru Cercetare (32X-10860); si un premiu pentru cariera de dezvoltare (2-2006-108) de la Juvenile Diabetes Research Foundation.

Note de subsol

  • ↵ 1 Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: mkakokimed.unc.edu sau oliver_smithiesmed.unc.edu .