Andrew Khayrullin

1 Colegiul Medical din Georgia, Universitatea Augusta, CB1116 B-dul Laney Walker, Augusta, GA 30912, SUA; ude.atsugua@nilluryahka (A.K.); ude.atsugua@nanhsirkp (P.K.); ude.atsugua@ehdnemb (B.M.); ude.atsugua@uiltuy (Y.L.)

Priyanka Krishnan

1 Colegiul Medical din Georgia, Universitatea Augusta, CB1116 B-dul Laney Walker, Augusta, GA 30912, SUA; ude.atsugua@nilluryahka (A.K.); ude.atsugua@nanhsirkp (P.K.); ude.atsugua@ehdnemb (B.M.); ude.atsugua@uiltuy (Y.L.)

Luis Martinez-Nater

2 Școala de Medicină, Universitatea Central Del Caribe, Bayamon, PR 00960, SUA; ude.ebiraccu@zenitraml611 (L.M.-N.); ude.atsugua@elezlufs (S.F.)

Bharati Mendhe

1 Colegiul Medical din Georgia, Universitatea Augusta, CB1116 B-dul Laney Walker, Augusta, GA 30912, SUA; ude.atsugua@nilluryahka (A.K.); ude.atsugua@nanhsirkp (P.K.); ude.atsugua@ehdnemb (B.M.); ude.atsugua@uiltuy (Y.L.)

Sadanand Fulzele

2 Școala de Medicină, Universitatea Central Del Caribe, Bayamon, PR 00960, SUA; ude.ebiraccu@zenitraml611 (L.M.-N.); ude.atsugua@elezlufs (S.F.)

Yutao Liu

1 Colegiul Medical din Georgia, Universitatea Augusta, CB1116 B-dul Laney Walker, Augusta, GA 30912, SUA; ude.atsugua@nilluryahka (A.K.); ude.atsugua@nanhsirkp (P.K.); ude.atsugua@ehdnemb (B.M.); ude.atsugua@uiltuy (Y.L.)

Julie A. Mattison

3 Institutul Național pentru Îmbătrânire, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, MD 20892, SUA; vog.hin.liam@jnosittam

Mark W. Hamrick

1 Colegiul Medical din Georgia, Universitatea Augusta, CB1116 B-dul Laney Walker, Augusta, GA 30912, SUA; ude.atsugua@nilluryahka (A.K.); ude.atsugua@nanhsirkp (P.K.); ude.atsugua@ehdnemb (B.M.); ude.atsugua@uiltuy (Y.L.)

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Povara sănătății publice a bolilor legate de vârstă crește rapid pe măsură ce populația îmbătrânită crește la nivel global. Asistența acordată persoanelor cu boală Alzheimer (AD) în 2016 a atins o valoare economică estimată la 221,3 miliarde de dolari, iar costul asistenței medicale al fracturilor osteoporotice din SUA a fost estimat la 14 miliarde de dolari. Modele emergente de progresie a bolii sugerează că modificările degenerative într-un organ sau sistem sunt susceptibile de a contribui la modificări degenerative în alte organe și sisteme. De exemplu, s-a observat că reducerea masei slabe și a pierderii osoase precede dezvoltarea vârstei a afectării cognitive și a AD [1,2]. Astfel, discuțiile încrucișate între diferite celule, țesuturi și organe pot sta la baza îmbătrânirii neautonome în diferite populații de celule și țesuturi. Acest concept este susținut de studii în care celulele tinere expuse serului în vârstă au prezentat modificări caracteristice celulelor mai în vârstă [3,4].

Un obstacol în calea progresului în corectarea problemei disfuncției țesuturilor legate de vârstă este înțelegerea slabă a mecanismelor moleculare și celulare care stau la baza acestor căi de comunicații celulare neautonome. Exosomii sunt mici (40-150 nm), iar microvesiculele sunt structuri mai mari (> 100 nm) derivate din membrană, care sunt eliberate în spațiul extracelular de către o varietate de tipuri de celule [5]. Aceste vezicule extracelulare legate de membrană (EV) pot transporta proteine, lipide și ARNm între celule, livrând aceste molecule către celulele țintă prin endocitoză și fuziune membranară [5,6]. Comunicarea celulă bazată pe EV reprezintă, prin urmare, o cale nouă pentru reprogramarea epigenetică a celulelor țintă [7]. VE sunt extrem de îmbogățite în ceramida sfingolipidă [8,9], despre care se știe că promovează senescența celulară și apoptoza [10,11,12,13]. În plus, EV joacă un rol cheie într-o serie de patologii in vivo, cum ar fi metastaza cancerului [14,15] și boala neurodegenerativă [9,13,16,17]. Astfel, ceramida derivată din EV este un factor potențial de îmbătrânire care poate promova degenerarea în mai multe organe și țesuturi.

2. Materiale și metode

2.1. Probele de ser, izolarea EV și caracterizarea EV

ceramida

Izolarea și caracterizarea EV-urilor vechi și tinere. (A) Spectrul peptidic se potrivește pentru o singură probă EV serică umană izolată folosind fie cromatografia de excludere a mărimii (SEC), fie 8% polietilen glicol (PEG). Primele două fracțiuni EV (F1/F2) din izolarea SEC arată un număr mai mare de markeri EV cunoscuți comparativ cu izolarea PEG. (B) Cuantificarea Zetaview a mărimii particulelor serice EV de la donatori tineri (25-40 ani) și vârstnici (75-90 ani) caucazieni, femei. (C) Profil lipidomic ceramidic al EV izolat din serul femeilor tinere și mai în vârstă (n = 5 pe grupă de vârstă, bare de eroare = SD). Rețineți că EV-urile de la femeile în vârstă sunt foarte bogate în ceramidă C24: 1. (D) Parcele de cutii și mustăți ale valorilor ceramidei C24: 1 transformate la rang ale EV de la maimuțele rhesus. EV-urile din serul maimuțelor în vârstă (n = 8) arată o creștere semnificativă a ceramidei C24: 1 comparativ cu EV-urile serice izolate de maimuțele mai tinere (n = 8). Valorile au fost convertite în ranguri și ANOVA cu un singur factor a fost efectuat cu vârsta ca factor.

Apoi am obținut cinci probe de ser de femei tinere (25-40 de ani) și cinci probe de femei mai în vârstă (75-90 de ani), toate caucaziene, non-diabetice, nefumători de la ReproCell (Beltsville, MD, SUA) pentru izolarea EV folosind SEC. Femeile au fost selectate deoarece prezintă o incidență mai mare atât a bolii Alzheimer, cât și a osteoporozei. Analiza de urmărire a nanoparticulelor a fost efectuată utilizând instrumentul ZetaView din Particle Matrix. Eșantioanele de ser atât ale femeilor tinere, cât și ale celor în vârstă prezintă dimensiuni ale particulelor în intervalul de 100 nm, în concordanță cu mărimea cunoscută a exosomilor (Figura 1 B). Am obținut probe de ser de la opt tineri (6-10 ani) și bătrâni (25-30 ani) Macaci rhesus sănătoși (Macaca mulatta) de la Institutul Național pentru Îmbătrânire și EV-uri izolate din aceste probe folosind SEC, așa cum am făcut pentru om probe.

2.2. Analiza lipidomică a EV-urilor serice

Probele de ser EV izolate de la femeile tinere și mai în vârstă descrise mai sus, precum și probele izolate de la maimuțe tinere și vârstnice au fost analizate pentru ceramide cu lanț scurt, lung și foarte lung la unitatea de bază lipidomică de la Universitatea Medicală din Carolina de Sud (MUSC), Charleston, SC. Probele au provenit din fracțiuni F1 și F2 grupate, izolate folosind SEC și analizate pe un sistem de spectrometrie de masă în tandem (HPLC-MS/MS) de cromatografie lichidă de înaltă performanță Thermo Scientific; datele au fost normalizate la niveluri de fosfat anorganic/probă.

2.3. Studii in vitro privind absorbția exozomilor

Am izolat vezicule extracelulare din serul oamenilor adulți (25-40 de ani) folosind SEC așa cum s-a descris mai sus pentru probele de ser uman și de maimuță. EV-urile au fost colorate cu colorantul membranar lipofil PKH67 pentru a marca veziculele extracelulare. Am tratat apoi BMSC umane primare (Lonza, MD, SUA) cu EV-uri marcate cu PKH67. Celulele au fost fotografiate folosind microscopie confocală în Facultatea de bază pentru imagistica celulară a Colegiului Medical din Georgia.

2.4. Încărcarea ceramidei C24: 1 în exosomi și analiza senescenței celulare

2.5. Analiza PCR în timp real a expresiei sfingomielinazei

Ficatul este principala sursă de circulare a ceramidei [18,19]. Ceramida poate fi produsă în ficat în două moduri, fie prin sinteză de novo, fie prin hidroliza sfingomielinei [35]. Ceramida sintază 2 (CerS2) este sintaza primară implicată în sintetizarea ceramidei C24: 1 cu lanț lung prin calea de novo [36,37], în timp ce sfingomielinaza neutră 2 (nSMase2) este implicată în principal în producția de ceramidă prin hidroliza sfingomielină [35]. Prin urmare, am comparat expresia CerS2 și nSMase2 între ficatul de șoareci femele adulți în vârstă (22 luni, n = 4) și tineri (6 luni, n = 4) pentru a determina care cale poate fi implicată în ceramida C24: 1 crescută observată cu vârsta. Ficatele au fost înghețate rapid în azot lichid după ce șoarecii au fost eutanasiați prin supradozaj de CO2 și toracotomie. ARNm a fost izolat din ficat folosind coloane de rotire RNeasy (Qiagen), în conformitate cu specificațiile producătorului. qRT-PCR a fost efectuată folosind următoarele exemple de secvențe cu media expresiei ARN GAPDH și 18s ca control de normalizare. CerS2 FWD AAGTGGGAAACGGAGTAGCG, CerS2 REV ACAGGCAGCCATAGTCGTTC, nSMase2 FWD ACACGACCCCTTTCCTAATA, nSMase2 REV GGCGCTTCTCATAGGTGGTG.

2.6. Analize statistice

Datele lipidomice au fost comparate utilizând ANOVA cu un singur factor cu vârsta ca factor și testul Fishers LSD utilizat pentru comparații post-hoc. Comparații perechi au fost, de asemenea, efectuate pe date transformate în rang pentru a reduce influența observațiilor periferice. Testele t au fost utilizate pentru comparații perechi ale expresiei ceramidei sintazei.

3. Rezultate

3.1. C24: 1 Ceramida crește odată cu vârsta la veziculele extracelulare de la subiecți umani mai în vârstă și primate neumane

Analizele lipidomice ale veziculelor extracelulare serice indică faptul că EV-urile serice de la femeile în vârstă sunt bogate în ceramidă C24: 1 (15,4 pmol/probă) și diferă semnificativ (p Figura 1 C). Similar studiilor la om, EV-urile izolate de maimuțele în vârstă prezintă o creștere semnificativă (p Figura 1 D). Valorile pentru probele de ser de primate neumane au fost similare cu cele din studiile la femei cu cantități crescute de ceramidă C24: 1 la maimuțele mai în vârstă. Aceste constatări sunt importante din punct de vedere clinic, deoarece ceramida C24: 1 este semnificativ crescută în serul adulților mai în vârstă cu capacitate cardiovasculară mai mică [38], cu un risc mai mare de boli cardiovasculare [39] și cu insuficiență a memoriei [40].

3.2. EVS serice sunt endocitate de celulele stem ale măduvei osoase

BMSC primare umane au fost tratate cu EV serice izolate din ser uman și marcate cu colorant PKH67. Clusterele de EV-uri marcate sunt abundente în citosolul celulelor stem ale măduvei osoase, indicând faptul că celulele absorb cu ușurință aceste vezicule (Figura 2).