Biswadip Das

De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,

defectul

Melanie N. Cash

De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,

Bently Robinson

De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,

Christopher S. Kuhns

De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,

Lisa R. Latchney

§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,

Margaret A. Fallon

§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,

Rosemary W. Elliott

Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară, Roswell Park Cancer Institute, Departamentul de Sănătate din New York, Buffalo, New York 14263 și

Arthur R. Hand

‖ Departamentele de Științe Craniofaciale și Biologie Celulară, Școala de Medicină Dentară, Universitatea din Connecticut Health Center, Farmington, Connecticut 06030

David J. Culp

De la Departamentul de Biologie Orală, Colegiul de Medicină Dentară, Universitatea din Florida, Gainesville, Florida 32610,

§ Centrul de biologie orală, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642,

Date asociate

Abstract

Introducere

Mucinele sunt glicoproteine ​​puternic glicozilate ale căror gene sunt desemnate ca MUC1 până la MUC22, pe baza ordinii lor de descoperire. Mucinele sunt grupate în trei familii: 1) mucine mari care formează gel și secretă, 2) mucine solubile și secretate și 3) mucine asociate membranei (1, 2). Mucinele mari care formează gel sunt formate din Muc2, Muc5ac, Muc5b, Muc6 și Muc19. Mucinele care formează gel sunt produse de secreție exocrină ale celulelor calice de suprafață și ale celulelor mucoase glandulare ale căilor respiratorii, ale tractului digestiv, ale sistemului urogenital, ale ochilor, urechii interne și ale sistemului salivar. Aceste mucine se polimerizează în rețele macromoleculare care conțin apă cu funcții de protecție, inclusiv hidratarea și lubrifierea suprafețelor țesuturilor, precum și interacțiunea cu agenții patogeni, fie singuri, fie ca parte a unor complexe moleculare mari cu alte molecule secretate în stratul de mucus (3, 4) . În saliva umană, MUC5B este bine recunoscut ca un constituent major al mucinei (5), iar transcrierile MUC19 sunt localizate în celulele mucoase ale glandelor salivare (6).

Ca o abordare alternativă în delimitarea mecanismelor care controlează expresia Muc19, am studiat modelul mouse-ului NFS/N-sld. Acești șoareci găzduiesc o mutație spontană autosomală recesivă, sld, caracterizată inițial ca dezvoltarea întârziată și limitată a celulelor mucoase în glandele salivare sublinguale (15-17). De atunci am demonstrat că mutația sld perturbă expresia Muc19, după cum reiese din studiile ultrastructurale și imunohistochimice, dar fără efecte asupra expresiei altor proteine ​​secretate, precum și asupra expresiei proteinei globale (15). Deoarece Muc19 este singura mucină formatoare de gel a glandelor sublinguale, glandele neonatale ale șoarecilor sld sunt lipsite de granulele exocrine mari tipice fenotipului celulelor mucoase. Cu toate acestea, fenotipul celulelor mucoase începe să apară și să crească în număr de celule postnatal. Toate aceste celule exprimă Muc19, dar sunt restricționate deoarece celulele fenotipului celulelor mucoase reprezintă mai puțin de jumătate din populația de celule la vârsta de 1 an (15). În mod corespunzător, transcrierile Muc19 sunt abia detectabile, iar glicoproteinele Muc19 sunt nedetectabile la nou-născuții, deși ambele apar treptat postnatal coroborate cu apariția crescândă a celulelor fenotipului celulelor mucoase (15).

PROCEDURI EXPERIMENTALE

Materiale

Cu excepția cazului în care este indicat, toate sărurile și tampoanele de bază au fost de la Sigma, iar reactivii și kiturile moleculare, enzimele și reactivii de cultură au fost de la Invitrogen. Toate kiturile au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului.

Animale și colecția de glande

Universitatea din Florida, Universitatea din Cincinnati și Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității din Rochester au aprobat toate procedurile pentru animale. Șoarecii NFS/NCr și NFS/N-sld provin din propriile colonii de reproducere menținute în condiții BSL2. Șoarecii NFS/NCr au fost obținuți inițial din programul pentru animale al Institutului Național al Cancerului (Charles River Laboratories, Frederick, MD). Șoarecii NFS/N-sld au fost obținuți inițial de la Institutul Central pentru Animale Experimentale (Kawasaki, Japonia) așa cum s-a descris anterior (15). Șoarecii au fost eutanasiați prin exsanguinare după narcoză cu dioxid de carbon. Dacă nu este indicat, toate țesuturile excizate au fost șterse pe hârtie de filtru, congelate rapid și depozitate în azot lichid. Pentru a determina greutatea umedă, țesuturile înghețate au fost cântărite rapid înainte de a fi utilizate cu o microbalanță Mettler MT-5 (Mettler Toledo, Columbus, OH).

Cartografierea genetică și RT-PCR a transcrierilor în regiunea critică

ADN-ul genomic a fost izolat din rinichi folosind trusa DNeasy (Qiagen). Markeri genomici polimorfi (site-uri marcate cu secvență (STS)) 3 au inclus STS-urile stabilite din Massachusetts Institute of Technology (MIT) și markeri STS D15Roc1-12 pe care le-am proiectat din repetiții simple genomice identificate de programul COMPILE_SIMPLE al serverului de adnotare a secvenței RUMMAGE . Localizarea cromozomială și dimensiunile ampliconului STS MIT sunt în tabelul suplimentar S1. Exemplele de secvențe, dimensiunile ampliconului, numerele de acces GenBank TM pentru D15Roc1-12 și condițiile PCR sunt date în tabelul suplimentar S2. Pentru fenotipul mutanților sld, omogenatele glandei sublinguale preparate din șoareci F2 la vârsta de 3 săptămâni au fost testate pentru prezența sau aproape absența (fenotipul mutant) a glicoproteinelor cu greutate moleculară mare.

Pentru a izola ARN-ul, țesuturile înghețate au fost omogenizate direct în reactiv TRIzol folosind un Mini Bead Beater 8 (Produse BioSpec, Bartlesville, OK) timp de 90 de secunde în prezența a ± 500 mg de bile de carbură de silicon (dimensiune 1 mm). ARN-ul a fost izolat conform instrucțiunilor producătorului și tratat cu DNază I folosind kitul de reactivi ADN-Ambion (Applied Biosystems, Foster City, CA). Puritatea ARN a fost evaluată prin electroforeză capilară (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Numărul de integritate ARN a variat între 8,7 și 9,5. ARN-ul tratat cu DNază I (5 μg) a fost transcris invers cu primeri aleatori utilizând trusa de arhivă de cADN de mare capacitate (Applied Biosystems), iar ADNc rezultat a fost purificat cu sistemul de purificare QIAquick PCR (Qiagen). ARN și ADNc au fost cuantificate utilizând kitul de testare ARN Quant-iT sau kitul de testare Quant-iT dsDNA HS cu fluorometrul Qubit. Condițiile PCR și primerii specifici utilizați pentru detectarea transcrierilor în intervalul critic sunt în tabelul suplimentar S3. Produsele PCR au fost confirmate prin secvențierea directă a benzilor purificate cu gel (QIAquick kit de extracție cu gel; Qiagen).

Amplificarea PCR a ADNc Muc19, clonarea și secvențierea ADN-ului

Am secvențiat anterior ADNc Muc19 de la șoareci NFS/NCr de tip sălbatic (număr de acces GenBank ™> AY570293) (7). Pentru proiectul curent, o secvență de la capătul 5 'al șoarecilor mutanți NFS/N-sld cADN a fost derivată din trei clone suprapuse produse folosind kitul Qiagen RT-PCR într-un singur pas. ARN-ul total din glandele sublinguale adulte (1 μg; DNază digerată) a fost transcris invers timp de 30 min la 50 ° C cu primeri specifici și s-a efectuat PCR. Produsele au fost purificate cu gel și ligate în pCR Topo2.1, plasmidele rezultate au fost transformate în celule DH10b și ADN purificat din clone de celule expandate a fost secvențiat. Pentru o comparație directă, am clonat, de asemenea, secvența de la exonii 36-50 de șoareci NFS/NCr. Pentru a secvența capătul 3 ’al ADNc-ului Muc19 din exonii 50-60, am încorporat 3’-RLM-RACE (amplificarea rapidă mediată de ARN ligază a capetelor ADNc) folosind kitul Ambion First Choice RLM-RACE (Austin, TX). ARN din ambele tulpini de șoarece au fost amplificate și clonate. PCR-urile au inclus un primer 5'-exon 50-specific și primerul 3'-exterior RLM RACE. Reacția ulterioară a inclus primerul 3'-RLM RACE și același primer Muc19. Produsele au fost ligate, clonate și secvențiate (a se vedea tabelul suplimentar S4, de exemplu secvențe, dimensiuni ale ampliconului și condiții PCR pentru clonele de capăt 5 și 3).

Amplificarea PCR a ADN-ului genomic Muc19, clonarea și/sau secvențierea ADN-ului

Segmente genomice suprapuse ale Muc19/Smgc au fost amplificate folosind seturi de grunduri specifice (vezi Tabelele suplimentare S5 și S6 pentru secvențe de grund, dimensiunile ampliconului și condițiile PCR). Produsele purificate cu gel (kitul de purificare QiaQuick PCR) au fost fie secvențiate direct, fie clonate mai întâi folosind kitul de clonare PCR Topo XL. Secvențele au fost compilate în contigs folosind AssemblyALIGN (versiunea 1.0.9c; Oxford Molecular Group) și comparate folosind aliniamentele ClusTalW (MacVector, versiunea 7.2.2; Oxford Molecular Group). Toate secvențele au avut o acoperire de cel puțin 3 ori, fiecare dintr-un preparat ADN diferit. Toate secvențierile au fost efectuate la Centrul Interdisciplinar de Cercetare a Biotehnologiei de la Universitatea din Florida cu un analizor genetic Applied Biosystems 3100 cu chimie Big Dye (versiunea 3.1).

Generația de șoareci knock-out Muc19
PCR cantitativ în timp real (Q-PCR)

Testele Q-PCR au fost efectuate în triplicat și efectuate folosind un sistem PCR în timp real Applied Biosystems 7900HT și au inclus teste standard de exprimare a genei TaqMan (Applied Biosystems) pentru Muc19, Smgc, Lrrk2, Cntn1, Rn18s și Hprt. Pentru a testa pre-ARN-ul Muc19, am folosit un test personalizat TaqMan specific pentru intronul 19 și exonul 20. Toate sondele au fost etichetate cu 6-carboxi-fluoresceină.

Pentru cuantificarea absolută a analizelor, am pregătit șabloane de ADN purificat diluate în 50 ng/μl de ARN de drojdie pentru a genera curbe standard de la 10 2 la 10 10 număr de copii/reacție versus ciclu de prag (Ct), determinat din fluorescență de sistemul SDS 2.2. 1 software (Applied Biosystems). Curbele standard au fost utilizate pentru a determina eficiența amplificării (E = 10 (-1/n), unde n = panta curbei standard) în testele TaqMan, precum și numărul de copii ale șabloanelor din probele experimentale. Abundența relativă a transcrierilor a fost exprimată ca număr de copii pe nanogramă de ADNc normalizat la cel pentru gena de control endogenă. Diferențele în valorile normalizate au fost utilizate pentru a determina raportul relativ sau schimbarea de ori a expresiei transcrierii între două condiții (a se vedea tabelul suplimentar S8 pentru analize și primeri).

Pentru a analiza transcrierile aberante și corelate corect în apropierea capătului 3 ′ al lui Muc19, am folosit SYBR Green qPCR Master Mix (Applied Biosystems) cu grunduri concepute pentru produse corelate corect și corelate aberant și pentru Actb ca control endogen (a se vedea tabelul suplimentar S9, de exemplu secvențe și condiții de ciclism). Aceiași grunduri au fost folosite pentru a pregăti șabloane standard pentru cuantificarea numărului de copii pe reacție. Pentru a verifica dacă un singur produs a fost amplificat, au fost generate curbe de disociere pentru toate reacțiile.

SDS-PAGE și Western Blots

Procedurile au fost cele descrise anterior (11) cu modificări minore. Probele au fost prelevate pe geluri NuPAGE Bis-Tris de 4-12% și colorate pentru proteinele cu Coomassie Blue sau colorate pentru glicoproteine ​​puternic glicozilate cu albastru Alcian urmate de îmbunătățirea ulterioară a argintului. Pentru a detecta Muc19 în Western blots, bloturile (nitroceluloză, 0,2 μm; GE Healthcare) au fost sondate peste noapte la 4 ° C cu iepure anti-Muc19 (1: 20.000). Specificitatea anticorpilor pentru Muc19 a fost prezentată recent (11). Au fost utilizate standarde proteice Novex Sharp.

Imunohistochimie și microscopie electronică

Imunohistochimia a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (11) pe secțiuni de parafină de 5 μm fixate în paraformaldehidă 4% și sondate cu iepure anti-Muc19 (diluție 1: 1.000). Imunodetecția a fost fie cu Alexa Fluor 568 capră anti-iepure IgG (1: 250), fie cu metoda complexului avidin-biotin-peroxidază (kit Vectastain Elite) cu diaminobenzidină ca substrat peroxidazic. Microscopia electronică a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (11).

Imunoprecipitarea cromatinei
Analiza stabilității ARN

Glandele sublinguale au fost excizate de la șoareci (7-10 săptămâni) și tubuloacini dispersați enzimatic, preparați utilizând o modificare a protocolului nostru pentru șobolani (8). Glandele de la 10 șoareci au fost tocate și incubate în 10 ml mediu conținând 100 unități/ml colagenază (Worthington CLSPA) și 40 unități/ml hialuronidază. Alicote de tubuloacine proaspăt preparate și spălate au fost incubate la 37 ° C timp de 0, 1, 2, 4 sau 6 ore cu inhibitorul de transcripție, 5,6-diclorobenzimidazoleribozid (80 μm). ADNc-uri primate aleatoriu au fost testate folosind teste TaqMan Q-PCR pentru ARNm Muc19, ARNm Muc19 și ARNr 18S. Numerele de copiere au fost normalizate la ARNr 18S.

RACE-PAT

Am folosit protocolul descris de Sallés și colab. (22). Pe scurt, ARN-ul total (50 ng) din glandele sublinguale a fost transcris invers în prezența dNTP-urilor de 1 mm, transcriptazei reversibile a virusului mieloblastozei aviare (Promega) și a 200 ng a unui adaptor 3 ′ (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTT ° C timp de 1 oră. ADNc rezultat a fost folosit ca șablon pentru PCR-uri ulterioare utilizând Accuprime de înaltă fidelitate Taq ADN polimerază, primerul direct (5'-GGACCAGTGTGAACAGTCTAA-3 'specific Muc19/Smgc exon 60 și primerul invers (5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3') specific Profilurile de ciclism PCR au fost: 94 ° C timp de 2 minute urmate de 39 de cicluri (94 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 30 s și 68 ° C timp de 60 s) și 5 min de extensie la 68 ° C. Produsele PAT au fost rezolvate în geluri de agaroză NuSieve 3: 1 3,5%.

Minigene Splicing Assay

Minigenii substratului pre-ARNm din regiunile genomice specifice de la șoareci de tip sălbatic și șoareci mutanți sld au fost produși și transformați în linia celulară de hepatom de șoarece, Hepa 1-6 (ATCC). Celulele au fost crescute în DMEM cu 10% FBS și transformate folosind reactiv lipofectaminic (0,5-2 μg de ADN în 1,6 ml de mediu în plăci cu 6 godeuri timp de 5 ore) urmate de selecția G418 și secvențierea pentru a verifica inserțiile de ADN de șoarece adecvate. PCR de ADNc cu amorsare aleatorie a conținut primeri specifici exonilor, precum și la controlul încărcării, neomicin fosfotransferază, prezent în toate constructele. Toate produsele au fost confirmate prin secvențierea directă. Grundele și condițiile PCR sunt date în tabelul suplimentar S9.

Pentru a crea minigenele care codifică exonii 57–58 și exonii 53–55, am folosit ca șabloane clonele genomice produse anterior și secvențiate, așa cum se indică în tabelul suplimentar S5, care conțin exonii 57–60 (> HM132020 și> HM132021) și exonii 53–55 56 (> HM132018 și> HM132019). Primerii și condițiile PCR sunt date în tabelul suplimentar S9. Produsele PCR au fost donate direct în pCR Topo2.1. Inserturile au fost apoi excizate (HindIII-XhoI pentru intronii 52-55 și HindIII-BstXI pentru intronii 56-58), iar fragmentele au fost clonate în site-uri identice ale vectorului de expresie pcDNA 3.1 (+). Plasmidele rezultate au fost transformate în celule DH10b.

Pateamine A Experiments

În trei experimente separate, glandele sublinguale proaspăt excizate de la trei șoareci sld mutanți la vârsta de 8 săptămâni au fost mărunțite mărunt în fragmente mici mai mici de 1 mm 3, spălate de trei ori cu PBS și cultivate timp de 2 ore în aceleași condiții ca tubuloacini dispersați enzimatic, așa cum este descris mai sus, cu excepția a fost adăugată fie pateamina A de 2 nm (furnizată cu amabilitate de Dr. Jerry Pelletier), fie Me2SO (controlul vehiculului). ARN-ul a fost extras imediat în reactiv TRIzol și tratat cu DNază I, iar cADN-urile primate aleatoriu au fost testate folosind SYBR Green qPCR Master Mix (Applied Biosystems) cu grunduri pentru produse corelate corect și aberant, așa cum este descris mai sus.

Statistici

Comparații statistice au fost efectuate cu software-ul Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).