Catarina Rippe

* Departamentul de biologie celulară și moleculară, secțiunea pentru semnalizare moleculară, Universitatea din Lund, Lund, Suedia

Karin Berger

* Departamentul de biologie celulară și moleculară, secțiunea pentru semnalizare moleculară, Universitatea din Lund, Lund, Suedia

Jie Mei

* Departamentul de biologie celulară și moleculară, secțiunea pentru semnalizare moleculară, Universitatea din Lund, Lund, Suedia

Mark E. Lowe

† Departamentele de pediatrie și biologie moleculară și farmacologie, Washington University School of Medicine și St. Spitalul de Copii St. Louis, St. Louis, Missouri, S.U.A.

Charlotte Erlanson-Albertsson

* Departamentul de biologie celulară și moleculară, secțiunea pentru semnalizare moleculară, Universitatea din Lund, Lund, Suedia

Abstract

Introducere

S-a demonstrat că o dietă care conține o cantitate mare de grăsimi, în studii pe termen scurt, crește expresia lipazei pancreatice și a colipazei.

Pentru a investiga efectele hrănirii pe termen lung cu conținut ridicat de grăsimi (113 zile) asupra expresiei ARNm a lipazei pancreatice, colipazei, proteinelor lipazice pancreatice (1 și 2) și a decuplării proteinelor în timpul obezității și al intoleranței la glucoză.

Metodologie

Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi, fie cu o dietă standard și au fost uciși după 3, 13, 57 și 113 zile. Țesuturile adipoase maronii și albe din pancreas au fost colectate pentru extracția ARNm.

Rezultate

Șoarecii cu hrană bogată în grăsimi au devenit obezi și intoleranți la glucoză cu 113 zile. Dieta bogată în grăsimi a crescut lipaza (p Tabelul 1). Hrana și apa erau disponibile ad libitum. Șase șoareci din fiecare grup au fost uciși în ziua 3, ziua 13, ziua 57 și ziua 113. Țesutul adipos alb și țesutul adipos maro din pancreas au fost colectate rapid și înghețate imediat în azot lichid.

TABELUL 1

Conținutul de macronutrienți al dietelor

Conținut Dieta bogată în grăsimi (g/100 g) Dieta standard (g/100 g)
Proteină3121
Carbohidrați1743
Gras36,9 a 5 b
Energie (%)
Proteină2428
Carbohidrați1357
Gras6315

Toleranță la glucoză

În ziua 0, 57 și 113, a fost efectuat un test de toleranță la glucoză pe cinci șoareci din fiecare grup, separați de șoarecii utilizați pentru colectarea probelor de țesut. Șoarecii au fost posti timp de 5 ore (începând între 7 și 9 AM), anesteziați cu pentobarbital de sodiu (20 mg/kg i.p.) și injectați i.p. cu o soluție de glucoză (1 mg glucoză/g greutate corporală). Probele de sânge de la acești șoareci au fost colectate din vena cozii (15 μL), iar glucoza a fost imediat măsurată cu ajutorul indicatorului de glucoză Accutrend (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Suedia).

Izolarea ARN-ului și a Northern blot

ARN a fost extras din diferite țesuturi conform lui Chomczynski (24). Un total de 20 μg ARN a fost separat pe un gel de agaroză 1% conținând 2% formaldehidă și transferat la o membrană de nailon (Zeta-Probe, Bio-Rad, CA). Prehibridizarea și hibridizarea s-au efectuat peste noapte fie la 60 ° C (pentru sonde lipază, colipază și UCP), fie la 37 ° C (pentru sonda 18S). Sondele au fost etichetate cu (α- 32 P) dCTP (Amersham, Pharmacia Biotech, Marea Britanie) folosind un kit de traducere nick (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germania), în timp ce sonda 18S a fost etichetată final folosind polinucleotid kinaza T4 (Life Technologies AB, Täby, Suedia) și (γ- 32 P) ATP. Filtrele au fost spălate timp de 10 minute în 0,20 mM Na2HPO4, 5% SDS, pH 7,2 și 10 minute în 0,20 mM Na2HPO4, 1% SDS, pH 7,2. Intensitatea sondelor legate a fost analizată cu un fosfo-imager (Fujix, Bas 2000). Rehibridarea cu sonda 18S a fost realizată așa cum s-a descris mai sus la 37 ° C. Nivelurile de mARN de lipază, colipază, PLRP1, PLRP2 și UCP au fost comparate cu standardul 18S și exprimate în unități arbitrare.

Sonde

Sondele pentru UCP1 și UCP2, precum și pentru lipaza pancreatică de șoarece, PLRP1 și PLRP2 au fost descrise anterior (14,19). Sonda ARNr 18S a fost achiziționată de la DNA Technology (Danemarca).

Western blot

Țesutul pancreasului de la șoareci uciși în zilele 3, 57 și 113 a fost omogenizat și s-au aplicat 10 μg proteine ​​totale pe un gel SDS-poliacrilamidă 10%. Proteinele au fost transferate într-o membrană ProBlott (Applied Biosystems), iar proteina lipazică a fost detectată prin imunocolorare cu ajutorul unui antiser lipazic policlonal diluat 1/500 (o lipază anti-porcină-lipază, care recunoaște atât lipaza pancreatică de șobolan, cât și de șoarece) și dezvoltată cu chemoluminescență.

Analize statistice

hrănirii

Toleranță la glucoză. Un test i.p de toleranță la glucoză (1 mg glucoză/g greutate corporală) a fost efectuat în trei momente diferite: ziua 0, ziua 57 și ziua 113 (n = 5 în toate momentele). O diferență statistică între șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi și șoarecii hrăniți standard a fost observată în ziua 113 (p Fig. 1A). În schimb, șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi au avut o creștere semnificativă a greutății corporale (p Fig. 1B). Deoarece a existat o interacțiune între dietă și timp în greutatea epididimului, a fost efectuat un test t cu corecția Bonferroni. Această analiză a arătat semnificație în fiecare moment: ziua 3, p = 0,03; ziua 13, p = 0,02; ziua 57, p = 0,04; și ziua 113, p = 0,01.

Lipazele pancreatice și expresia colipazei

Hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi a crescut semnificativ expresia mARN-ului lipazei în comparație cu hrănirea standard (p Fig. 3A). Creșterea a avut loc rapid, în primele 3 zile de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi (a crescut cu 39%) și a persistat timp de 57 de zile (prezentând o creștere de 33% și 26% în zilele 13 și, respectiv, 57). Cu toate acestea, la sfârșitul experimentului, nivelurile de mARN ale lipazei la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi au scăzut la aceleași niveluri ca și la șoarecii hrăniți standard. În comparație, nivelurile de ARNm colipază au crescut treptat pentru ambele grupuri în primele 57 de zile (Fig. 3B). Cu toate acestea, nivelurile de ARNm colipază au scăzut cu 100% în ziua 113, cu continuarea alimentării cu conținut ridicat de grăsimi (p Fig. 3B).

expresie mARN a lipazei (A) și colipaza (B) după hrănirea îndelungată cu conținut ridicat de grăsimi. C: Un blot nordic reprezentativ. Bloturile nordice folosind ARN total din țesutul pancreasului au fost hibridizate cu sonde pentru lipază și colipază și exprimate în raport cu ARNr 18S. Valorile sunt exprimate ca medii ± SEM (n = 6).

Pentru a determina dacă modificarea nivelurilor de ARNm a corespuns unei modificări a nivelului de proteine, am analizat nivelurile de proteine ​​lipazice din extractele pancreatice prin imunoblotarea proteinelor. Nivelurile de proteine ​​lipazice au crescut după hrănirea bogată în grăsimi în zilele 3 și 57. În ziua 113, nivelurile de proteine ​​lipazice au scăzut atât pentru șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi, cât și pentru șoarecii hrăniți standard (Fig. 4).

Western blot, care arată conținutul de proteină lipază de la o pereche reprezentativă de animale la fiecare moment. 10 μg proteine ​​totale din omogenat pancreatic au fost aplicate pe un SDS-PAGE. A fost efectuată o Western blot, lipaza a fost detectată cu anticorpi și blot a fost vizualizată prin chemoluminescență. C, șoareci de control hrăniți cu o dietă standard; HF, șoarecii au hrănit o dietă bogată în grăsimi. Datele de la o pereche de animale sunt prezentate în fiecare moment.

Efectul unei diete bogate în grăsimi asupra expresiei ARNm a proteinelor de decuplare (UCP1 și UCP2) în țesutul adipos maro și alb. ARN celular total a fost extras din țesutul adipos maro și alb, examinat prin hibridizare Northern-blot și exprimat în raport cu ARNr 18S. A: Expresia mARN-ului UCP1 a crescut în zilele 57 și 113 (p 0,05, n = 6 la fiecare punct de timp) (Fig. 6B) sau în țesutul adipos alb (p> 0,05, n = 6 la fiecare punct de timp) (Fig. 6C) .

DISCUŢIE

În acest raport, arătăm, pentru prima dată, că hrănirea pe termen lung cu conținut ridicat de grăsimi provoacă obezitate și intoleranță la glucoză cu scăderi concomitente ale nivelurilor de ARNm lipazei pancreatice și colipazei la șoarecii RMN. Studiile anterioare au arătat că șoarecii RMN sunt sensibili la hrănirea pe termen lung cu conținut ridicat de grăsimi, dezvoltând atât obezitate, cât și rezistență la insulină (23). Studiul nostru distinge trei faze de adaptare în timpul hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi, așa cum este interpretat de greutatea corporală a animalelor. O primă fază (zilele 3-13), cu creșterea animalelor sănătoase, o a doua fază (zilele 13-57), cu animale sănătoase care ajung la greutatea corporală a adultului și o a treia fază (zilele 57-113), când –Animalele hrănite au devenit obeze și intolerante la glucoză.

În timpul primei faze, șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi au crescut mai repede și au dobândit tampoane mai mari de grăsime în comparație cu șoarecii hrăniți cu dieta standard (Fig. 1). Nu a existat nicio diferență între șoarecii hrăniți cu grăsimi și hrăniți standard în expresia UCP1 și 2 în ziua 13 (nu s-au obținut date în ziua 3), indicând faptul că o perioadă scurtă de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi nu a reușit să stimuleze dieta- termogeneza indusă (Fig. 6). Acești șoareci au avut o expresie crescută a mARN-ului lipazei și proteinei lipazei, ceea ce sugerează un control transcripțional al expresiei lipazei de către grăsimile din dietă (Fig. 3 și 4). 4). În schimb, ARNm care codifică colipaza a fost neschimbat în timpul acestei prime faze (Fig. 3). Mai mult, nu s-a observat nicio diferență în expresia ARNm care codifică PLRP2 cu o dietă bogată în grăsimi (Fig. 5). Cantitatea de ARNm care codifică PLRP1 a fost mai mică la șoarecii alimentați cu conținut ridicat de grăsimi în timpul acestei prime faze, sugerând că PLRP1 ar putea să nu fie implicat în digestia grăsimilor dietetice (Fig. 5). Cu toate acestea, s-a demonstrat că PLRP1 concurează cu lipaza pentru colipază, iar o scădere a PLRP1 ar crește astfel activitatea lipolitică a lipazei pancreatice.

Expresia crescută a mARN-ului lipazei și a proteinelor pentru șoarecii hrăniți cu grăsimi în prima fază este în concordanță cu studiile anterioare efectuate pe perioade mai scurte la șobolani (8-10). Deși creșterea expresiei lipazei pancreatice ar putea fi privită ca o încercare de creștere a capacității lipolitice a secrețiilor pancreatice în timpul hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi, lipsa modificării ARNm colipazei argumentează împotriva acestei posibilități. Raportul colipază/lipază la omogenatul pancreatic de șobolan și șoarece este de 0,5 (7). Deoarece lipaza și colipaza formează un raport molar 1: 1 în timpul hidrolizei triacilglicerolului, expresia colipazei este factorul limitativ al ratei pentru digestia grăsimilor.

În timpul celei de-a doua faze (zilele 13-57), ambele grupuri de șoareci au atins greutatea corporală a adulților și am observat o expresie crescută a ARNm UCP1 la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, ceea ce ar putea explica toleranța la glucoză și greutatea corporală păstrată în ciuda a dietei bogate în grăsimi. Interesant este faptul că mARN-ul UCP1 a crescut concomitent cu oprirea creșterii în greutate corporală, ceea ce susține un rol pentru UCP1 în termogeneza indusă de dietă, constatare în acord cu rapoartele anterioare (17). Nivelurile crescute de ARNm și proteine ​​ale lipazei au persistat în această perioadă. Mai mult, nu a existat încă nicio modificare a nivelurilor de ARNm colipază la animalele bogate în grăsimi. Răspunsul colipazei la o dietă bogată în grăsimi este controversat. Unii autori au raportat o creștere a colipazei rezultată dintr-o dietă bogată în grăsimi (26,27), iar alții nu au raportat nicio modificare (10,28, 29). În aceste studii, s-a constatat că expresia colipazei crește ca răspuns la o dietă cu un conținut mai ridicat de proteine ​​(10,28). De asemenea, s-a demonstrat că expresia colipazei este sensibilă la temperatura ambiantă, fiind exprimată maxim la 5 ° C (19.30). În mod clar, genele care codifică lipaza și colipaza nu sunt reglementate în mod coordonat, deoarece răspund diferit la dietele bogate în grăsimi, proteinele dietetice și temperatura.

În timpul celei de-a treia faze (zilele 57-113), șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi au devenit obezi și intoleranți la glucoză. În concordanță cu rapoartele anterioare, nivelurile de ARNm UCP1 au continuat să crească (18,19). Creșterea suplimentară a expresiei UCP1 nu a împiedicat creșterea în greutate și intoleranța la glucoză, ceea ce este de acord cu Margareto și colab. (31). Spre deosebire de UCP1, expresia ARNm a UCP2 nu a fost modificată în timpul hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi în țesutul adipos maro sau alb (Fig. 6B și C). O mare variabilitate a fost observată în ziua 57, care ar putea fi legată de o variație individuală în reglarea expresiei genei UCP2. S-a demonstrat în studii anterioare că animalele predispuse la obezitate nu își cresc expresia mARN-ului UCP2 în WAT, în timp ce animalele rezistente la obezitate sunt capabile să mărească transcriptul mARN-ului UCP2 (18,20). O lipsă a reglării superioare a UCP2 a fost, de asemenea, demonstrată în studiile anterioare (31,32). Cu toate acestea, Pecqueur și colab. au arătat că expresia ARNm a UCP2 nu este neapărat corelată cu expresia proteinelor și că proteina UCP2 nu a putut fi detectată în țesutul adipos maro, ceea ce ne conduce la întrebarea importanței expresiei UCP2 în BAT (33).

Scăderea nivelurilor de ARNm și proteine ​​lipazice pe care le-am observat la șoarecii hrăniți cu grăsimi și hrăniți standard la sfârșitul experimentului ar putea fi un fenomen legat de vârstă, deoarece există o reducere a secreției de lipază la oamenii mai în vârstă 34). În plus, Greenberg și Holt au descoperit că hrănirea șobolanilor bătrâni cu o dietă bogată în grăsimi (72% grăsime) timp de 7 zile nu a dus la modificarea expresiei lipazei, spre deosebire de șobolanii tineri, unde expresia lipazei a crescut (35).

În concluzie, am constatat că hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi pentru o perioadă mai scurtă crește expresia mARN-ului lipazei, indicând o adaptare a animalului la sarcina crescută de grăsime pentru a asigura digestia grăsimilor. De asemenea, am observat că expresia crescută a ARNm UCP1 a asigurat echilibrul energetic. Cu toate acestea, după expunerea prelungită la o dietă bogată în grăsimi, mecanismele implicate în reglarea digestiei grăsimilor și a echilibrului energetic se întrerup. După 4 luni de hrănire bogată în grăsimi, animalele au devenit obeze și intolerante la glucoză, în ciuda unei expresii crescute a UCP1. În același timp, atât expresia mARN a lipazei, cât și a colipazei au scăzut, sugerând o digestie grasă. Acest lucru ar putea fi interpretat fie ca un mecanism de apărare pentru a stopa dezvoltarea în continuare a obezității și a intoleranței la glucoză, fie ca un stop în reglarea generală a homeostaziei lipidice.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc lui Ulf Strömberg (Medicină a Muncii și Mediului, Universitatea din Lund, Suedia) pentru ajutorul acordat cu analizele statistice și profesorului Daniel Ricquier (Centre National de la Recherche Scientifique, Meudon, Franța) pentru furnizarea de sonde pentru proteinele de decuplare. Acest studiu a fost susținut de Consiliul Suedez de Cercetare (K2001-03X-07904-15A), Fundația A. Påhlssons, Fundația Crafoord și Royal Physiographic Society.