H.-J.L. și S.-B.J. a contribuit în mod egal la această lucrare.

excesul

Abstract

Introducere

Prevalența obezității și a patologiilor metabolice asociate a atras atenția asupra identificării factorilor etiologici (1,2). Obezitatea apare din factori genetici, de mediu și comportamentali care influențează echilibrul energetic. Principala caracteristică a obezității este acumularea excesivă de țesut adipos alb (WAT) (1,3-5). Deși obezitatea este înțeleasă a fi o consecință reglementată la nivel central a supranutriției și/sau a cheltuielilor reduse de energie, procesele care reglementează expansiunea WAT ​​la nivelul adipocitelor nu sunt bine caracterizate.

Expansiunea WAT ​​are loc prin hipertrofia și hiperplazia adipocitelor, astfel încât astfel de procese implică probabil la un anumit nivel procesul adipogenezei (3,4). Adipogeneza a fost analizată cu linii celulare de preadipocite cum ar fi 3T3-L1 și diverse linii de șoarece mutante (6). Aceste studii au elucidat o rețea transcripțională centrată în jurul membrilor familiei PPARγ și C/EBP, care determină diferențierea preadipocitelor în adipocite care acumulează lipide (6). Studii recente au identificat celule din fracția vasculară stromală (SVF) din WAT care sunt celule progenitoare adipocite de bună-credință (7,8). Astfel de celule din WAT trebuie să răspundă la indicii hormonali și locali care reglementează întreținerea homeostatică a acestui țesut. Indiciile care acționează asupra celulelor progenitoare adipocitare nu sunt bine înțelese, dar printre cele implicate se află calea de semnalizare Hedgehog (HH).

Proteinele HH reglează evenimentele de dezvoltare în organisme la fel de diverse precum insectele și mamiferele. Dintre proteinele HH de la mamifere, Sonic Hedgehog (SHH) joacă rolul cel mai larg și este implicat în creșterea și/sau morfogeneza multor structuri corporale (9). Proteinele HH activează o cale de transducție a semnalului conservată (10-12). În absența ligandului, receptorul primar HH PTCH1 funcționează pentru a inhiba semnalizarea de către o a doua proteină de membrană, SMO. Legarea HH la PTCH1 ameliorează inhibarea semnalelor SMO și SMO pentru a activa genele țintă ale căii prin intermediul factorilor de transcripție GLI. Printre astfel de gene țintă se numără Gli1 și Ptch1 în sine și sunt adesea utilizate ca citiri ale activității căii (10-12).

CDO (numit și CDON), BOC și GAS1 sunt proteine ​​de suprafață celulară care promovează activitatea căii HH ca coreceptori care leagă ligandul cu PTCH1 (13-20). CDO și BOC sunt proteine ​​transmembranare înrudite (21,22), în timp ce GAS1 este o proteină ancorată GPI, fără legătură cu CDO și BOC (23). Analiza șoarecilor cu mutații vizate în Cdon, Boc și Gas1 a relevat că, deși niciuna nu este esențială pentru activitatea căii HH, acestea sunt necesare în mod colectiv pentru funcția căii în embrionul timpuriu al șoarecelui (13,14,16,19). Un complex ternar de ligand HH, PTCH1 și cel puțin unul dintre acești coreceptori pare a fi necesar pentru transducția cu succes a semnalului (15,16,24). Șoarecii Boc-Null, subiectul acestui studiu, sunt viabile și fertili, dar prezintă defecte în modelarea neuronală SHH-dependentă și ghidarea axonului (19,25-28).

Calea HH reglează negativ adipogeneza. Activarea căii HH fie cu SHH, fie cu purmorpamină agonistă SMO a inhibat adipogeneza 3T3-L1 și a liniilor celulare suplimentare (29-32). Mai mult, blocarea semnalizării HH, cu o formă dominantă-negativă a GLI2 sau a ciclopaminei antagoniste SMO, a sporit adipogeneza acestor celule ca răspuns la factorii inducători (31,32). Semnalele HH au blocat etapele timpurii ale adipogenezei, în amonte de expresia PPARγ (29,31,32). Aceste studii sugerează că calea HH funcționează pentru a bloca diferențierea preadipocitelor in vitro. Experimentele la șoareci sunt în concordanță cu această noțiune. Șoarecii adulți homozigoti pentru o alelă hipomorfă a Ptch1 au prezentat o masă WAT redusă, care avea niveluri mai scăzute de markeri adiposi și niveluri crescute de gene țintă HH (33). Țesutul adipos - mutația specifică a unui alt inhibitor al căii HH, Sufu, a dus la pierderea WAT ​​(34). În cele din urmă, șoarecii cu obezitate indusă de dietă sau genetică (ob/ob) au prezentat o expresie scăzută a componentelor căii HH (31).

Deși șoarecii cu un câștig genetic de funcționare în activitatea căii HH au arătat pierderea WAT ​​(33,34), nu s-a demonstrat că șoarecii cu o pierdere a activității HH au adipozitate sporită. Raportăm că șoarecii cu mutație a liniei germinale în Boc prezintă supraponderalitate dependentă de vârstă datorită creșterii WAT. Acești șoareci prezintă, de asemenea, un răspuns exagerat la o dietă bogată în grăsimi (HFD), iar fibroblastele embrioni Boc -/- se diferențiază în adipocite mai eficient decât celulele de tip sălbatic. Aceste rezultate arată că BOC, acționând probabil ca un coreceptor SHH, este necesar pentru menținerea greutății normale in vivo și reglarea adecvată a diferențierii adipogene in vitro.

Proiectare și metode de cercetare

Pentru evaluarea parametrilor metabolici (Fig. 2), șoarecii Boc +/+ și Boc -/- în vârstă de 5 luni au fost analizați cu cuști metabolice (Aparatul Harvard; Panlab). Măsurătorile au fost efectuate timp de 48 de ore, timp în care animalele au avut acces la alimente și apă. Temperatura corpului de bază a fost măsurată cu un echipament homeotermic HB-101/pătură (aparat Harvard).

Histologie, colorare roșie ulei O și colorare fosfatază alcalină placentară

Pentru colorarea hematoxilin-eozinei (H-E), WAT și țesuturile hepatice au fost fixate și prelucrate pentru secțiuni de parafină de 20 μm. Pentru colorarea cu ulei roșu O, ficatul a fost fixat în PFA 4% și deshidratat prin gradient de zaharoză urmat de o criozecție compusă a temperaturii optime de tăiere (10 μm) și colorare cu ulei roșu O. Pentru colorarea Oil Red O a fibroblastelor embrionare de șoarece diferențiate (MEF) și a celulelor 3T3-L1, culturile au fost fixate în 10% formaldehidă timp de 10 min și colorate cu Oil Red O. Plăcile colorate au fost tratate cu 1 mL izopropanol/4% NP-40 timp de 10 min printr-o agitare ușoară, iar roșul de ulei extras O a fost cuantificat prin măsurarea densității optice la 520 nm. Pentru colorarea fosfatazei alcaline placentare (PLAP), țesuturile au fost fixate cu 2% PFA plus 0,2% glutaraldehidă timp de 2 ore la 4 ° C, spălate în PBS, permeabilizate în 0,3% Triton peste noapte la 4 ° C, spălate în soluție salină, căldură inactivate pentru 30 min la 72 ° C, spălat în NTM (100 mmol/L NaCI, 100 mmol/L Tris-HCI, pH 9,5, 50 mmol/L MgCl2) tampon și colorat cu purpuriu BM (Roche).

Culturi celulare

Pregătirea SVF din WAT a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (8). Pe scurt, WAT a fost tocat cu foarfeca și digerat cu 2 mg/ml de colagenază I (Sigma-Aldrich) în DMEM la 37 ° C timp de 1 oră. S-a adăugat DMEM plus 10% FBS pentru a dubla volumul, adipocitele plutitoare au fost îndepărtate și digestul a fost filtrat printr-o plasă de 100 μm care a reținut vasele fracției de particule stromale. Filtratul a fost centrifugat la 800 g timp de 5 minute, iar peleta SVF a fost resuspendată în DMEM conținând 10% FBS și cultivată timp de 2 zile.

Izolarea MEF primare a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (35). Celulele 3T3-L1 și MEF au fost cultivate în mediu de creștere (DMEM plus 10% FBS) la subconfluență. Pentru diferențierea adipocitelor, celulele au fost crescute până la confluență și trecute în mediu de diferențiere I (mediu de creștere plus 0,5 μmol/L IBMX, 1 μg/μL insulină, 0,25 μmol/L dexametazonă, 2 μmol/L rosiglitazonă; Sigma-Aldrich) timp de 2 zile . Mediul de cultură a fost apoi schimbat în mediu de diferențiere II (mediu de creștere plus 2 μmol/L rosiglitazonă), iar mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile. Pentru a activa semnalizarea SHH, MEF-urile au fost tratate cu 250 ng/mL SHH (sisteme R&D) sau 5,2 μmol/L purmorpamină (Calbiochem) în medii de diferențiere începând cu ziua de diferențiere 2 în continuare.

Imunoblotarea

Imunoblotarea a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (15). Anticorpii utilizați sunt enumerați în Tabelul 1.

Anticorpii utilizați în acest studiu

PCR și analiza cantitativă RT-PCR

Țesuturile au fost omogenizate cu FastPrep-24 (MP Biomedicals) și extrase cu trusa de extracție ARN (iNtRON). ADNc a fost generat cu PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) și amplificat cu nTaq polimerază (Enzynomics). RT-PCR cantitativ (qRT-PCR) a fost efectuat cu SYBR Green (Takara) și analizat cu un sistem TP8000 (Takara). Toate datele sunt normalizate la expresia proteinei ribozomale care codifică L32. Exemplele utilizate în acest studiu sunt enumerate în Tabelul 2.

Exemplele de secvențe utilizate în acest studiu

Imagistica

Microscopia a fost efectuată pe un Nikon ECLIPSE TE2000-U cu software-ul NIS-Elements F (Nikon), Zeiss AxioPlan 2 și Zeiss AxioPlan 2 IE. Adipocitele au fost urmărite și suprafața lor măsurată utilizând software-ul ImageJ.

Analize statistice

Excesul de greutate legat de vârstă la șoarecii Boc -/-. A: Cursul de timp al greutății corporale la șoarecii Boc +/+ (+/+) și Boc -/- (-/-). Valorile sunt mijloace ± SEM; n = 31-42 pentru șoareci Boc +/+ și n = 25-43 pentru șoareci Boc -/- în diferite momente de timp. * Șoareci P +/+ și Boc -/-. Rețineți că Boc -/- BAT este mai palid decât cel al controlului și are zone de albire evidentă (săgeți). E: H-E - secțiuni colorate de BAT de la șoareci Boc +/+ și Boc -/-. Bară, 50 μm. F: H-E - secțiuni colorate de WAT de la șoareci Boc +/+ și Boc -/-. Bară, 50 μm. G: Suprafața medie a adipocitelor din secțiuni de WAT adulte de la șoareci +/+ și -/-. Valorile sunt mijloace ± SD; n = 3. H: Distribuția zonelor adipocitare de la secțiuni de WAT adulte de la șoareci +/+ și -/-. Valorile sunt mijloace ± SD; n = 3. I: aport alimentar de la șoareci +/+ și -/- de 24 de săptămâni. BW, greutate corporală. Valorile sunt mijloace ± SD; n = 7.

Deoarece șoarecii Boc -/- nu erau hiperfagi, am evaluat dacă scăderea cheltuielilor energetice a contribuit la creșterea adipozității lor. Șoarecii normali Boc +/+ și Boc -/- în vârstă de 5 luni hrăniți cu chow (Fig. 2A) au fost folosiți pentru a evalua rata metabolică a întregului corp. Șoarecii Boc -/- au prezentat o temperatură corporală ușor mai scăzută decât șoarecii Boc +/+ (Fig. 2B). Activitatea locomotivă spontană la șoareci Boc -/- a avut în medie aproximativ jumătate din cea a șoarecilor martor, dar această diferență nu a fost semnificativă statistic și nu a existat nicio diferență în activitatea de creștere (Fig. 2C și D). Șoarecii Boc -/- au prezentat un consum ușor scăzut de oxigen și producția de dioxid de carbon în timpul fazei luminoase (Fig. 2E și F). Coeficientul respirator a fost ușor mai mic la șoarecii Boc -/- atât în ​​fazele întunecate, cât și în fazele luminoase, dar a fost în intervalul normal (Fig. 2G). Cheltuielile de energie ale șoarecilor Boc -/- au fost, de asemenea, ușor reduse în timpul fazei luminoase (Fig. 2H), dar cheltuielile totale de energie (întuneric plus lumină) nu au fost diferite. Aceste rezultate sugerează că șoarecii Boc -/- au modificări ale metabolismului întregului corp care pot contribui la supraponderalitatea lor.

Fenotipuri hepatice și WAT exacerbate la șoareci Boc -/- pe HFD. A: Ulei Roșu O - secțiuni hepatice colorate și H-E - secțiuni WAT colorate de la șoareci Boc +/+ și Boc -/- pe HFD. Bară, 50 μm. B: Suprafața medie a adipocitelor din secțiuni de WAT adulte de la șoareci Boc +/+ și Boc -/-. Valorile sunt mijloace ± SD; n = 3. * P +/+ și șoareci Boc -/- pe HFD. Valorile sunt mijloace ale nivelurilor relative de expresie ± SD; n = 3. *** Șoareci P +/+ și Boc -/- pe HFD. Valorile sunt mijloace ale nivelurilor relative de expresie ± SD; n = 3. *** Șoareci P +/+ și Boc -/- pe HFD. F: analiza qRT-PCR a expresiei genelor adipogene, lipidice și adipokine în WAT a șoarecilor Boc +/+ și Boc -/- pe HFD. Valorile sunt mijloace ale nivelurilor relative de expresie ± SD; n = 3. *** Șoareci P +/+ și Boc -/- pe HFD. H: analiza qRT-PCR a expresiei proteinelor de decuplare în BAT de șoareci Boc +/+ și Boc -/- pe HFD. Valorile sunt mijloace ale nivelurilor relative de expresie ± SD; n = 3. * P -/- MEF

Analiza expresiei Boc. A: analiza qRT-PCR a expresiei Boc în diferite țesuturi adulte. Valorile sunt mijloace ale nivelurilor relative de expresie ± SD; n = 3. Expresia L32 este setată ca 1. B: Colorarea fosfatazei alcaline a WAT ​​de la șoareci Boc +/+ și Boc +/− (rețineți că alela Boc - conduce expresia unei gene raportoare PLAP, desemnată aici Boc PLAP; vezi textul ) (A). Colorarea fosfatazei alcaline a adipocitelor WAT izolate de la șoareci Boc +/PLAP (b). Colorarea fosfatazei alcaline a vaselor izolate din SVF de la WAT ​​a șoarecilor Boc +/PLAP și a celulelor stromale sunt marcate cu săgeți (c). Colorarea fosfatazei alcaline a celulelor aderente din SVF de la WAT ​​a șoarecilor Boc +/PLAP (d). Colorarea DAPI a aceleiași culturi prezentată în d (e). C: Analiza semicantitativă RT-PCR a expresiei Boc și Pparγ în WAT, SVF și adipocite (Adip.). Gapdh a servit drept control de încărcare.

Expresia BOC a fost apoi analizată prin Western blot în timpul diferențierii preadipocitelor 3T3-L1. Nivelurile de BOC au fost relativ scăzute în timpul condițiilor de creștere și puternic induse când celulele au ajuns la confluență, chiar înainte de trecerea culturilor la mediu de inducție adipogenă (Fig. 6A). Nivelurile de BOC au fost parțial diminuate atunci când celulele au fost induse să se diferențieze, chiar înainte de exprimarea regulatorilor adipogeni PPARγ și C/EBPα, dar au fost readuse la vârf în timpul etapelor ulterioare de diferențiere (Fig. 6A). GAS1, un alt coreceptor SHH, a fost exprimat cu un model similar cu cel al BOC, deși efectul confluenței celulare nu a fost observat (Fig. 6A). Spre deosebire de BOC și GAS1, paralogul CDB BOC a fost abia detectat în celulele 3T3-L1. CDO a fost exprimat robust de către mioblastele C2C12, în timp ce nivelurile de BOC au fost scăzute în această linie celulară, în raport cu celulele 3T3-L1 (Fig. 6A).

Boc -/- MEF prezintă adipogeneză îmbunătățită. A: Analiza Western blot a diferitelor proteine ​​pe parcursul unui timp de diferențiere adipogenă a celulelor 3T3-L1. Lizatele culturilor de celule 3T3-L1 în mediu de creștere (G) la confluență de 60 și 100% (Cnfl.) Sau pentru numărul de zile indicat în mediu de diferențiere (DM) au fost șterse cu anticorpii indicați. β-Actina a servit drept control de încărcare. B: Adipogeneza îmbunătățită a MEF Boc -/- în raport cu MEF Boc +/+. Culturile au fost colorate cu ulei roșu O după 15 zile în mediu de diferențiere. C: Cuantificarea colorării roșu ulei O prin spectrofotometrie la o lungime de undă de 520 nm față de proba martor. Valorile sunt mijloace ± SD; n = 3. * P +/+ și Boc -/- MEF. L32 a servit drept control de încărcare. E: Analiza Western blot a diferitelor proteine ​​adipogene în Boc +/+ și Boc -/- MEF la D3 și D6.

Pentru a investiga rolul BOC în adipogeneză, am izolat MEF din embrionii E13.5 Boc +/+ și Boc -/- și le-am cultivat în mediu de inducție adipogenă timp de 15 zile (D15). Boc -/- MEF au avut mai multe colonii roșii petrolifere O pozitive la D15 decât au avut Boc +/+ MEF (Fig. 6B și C). Momentul inducerii genelor lipogene a fost similar între Boc +/+ și Boc -/- MEF, dar expresia fiecăruia a fost mai mare în Boc -/- MEF, așa cum a fost analizat prin RT-PCR semicantitativă (Fig. 6D). În plus, nivelurile de proteine ​​aP2, FAS și C/EBPα au fost crescute în MEF Boc -/- la D3 și D6, comparativ cu MEF de control (Fig. 6E). Prin urmare, similar cu rezultatele la șoareci Boc -/-, deficiența de Boc a dus la creșterea adipogenezei MEF in vitro.

Semnalizarea SHH suprimă adipogeneza, iar BOC promovează semnalizarea SHH ca coreceptor (16,18,20). Efectele deficitului de BOC asupra adipogenezei pot fi, prin urmare, legate de efectele asupra semnalizării SHH. Am abordat inițial această întrebare analizând Boc +/+ și Boc -/- WAT adulți pentru nivelurile de ARNm ale diferitelor componente de semnalizare SHH prin qRT-PCR. Am examinat expresia Cdo, Gas1, Ptch1 și Gli1; aceste gene nu numai că codifică componente ale căii SHH, dar expresia lor este, de asemenea, reglementată de activitatea căii SHH (expresia Ptch1 și Gli1 este indusă; expresia Cdo și Gas1 este reprimată, cel puțin la embrionii timpurii ai șoarecilor [11,18]). Expresia Cdo, Gas1 și Ptch1 a fost semnificativ mai mică în Boc -/- WAT, comparativ cu Boc -/- WAT, în timp ce expresia Gli1 a fost similară (Fig. 7A). Aceste rezultate nu sugerează imediat o modificare majoră a semnalizării SHH în Boc -/- WAT, dar poate fi simplist să presupunem că expresia acestor gene este reglementată doar de activitatea SHH într-un țesut complex care este, de asemenea, perturbat de pierderea BOC.

Discuţie

Factorii genetici care contribuie la acumularea WAT ​​legată de obezitate sunt puțin înțelese. Calea HH joacă un rol conservat în adipogeneză, inhibând formarea grăsimilor (29-32). Șoarecii cu semnalizare HH crescută la nivel global datorită unei mutații hipomorfe Ptch1 sau în linia adipocitelor prin mutageneză țintită condiționată a Sufu, au scăzut brusc WAT (33,34). Deși aceste studii indică faptul că un câștig genetic al funcției în activitatea căii HH blochează adipogeneza, inversul nu a fost demonstrat, adică, funcția redusă a căii HH are ca rezultat acumularea WAT.

Informații despre articol

Finanțarea. Această cercetare a fost susținută de National Institutes of Health http://dx.doi.org/10.13039/100000002 grant AR-46207 (RSK) și de o Fundație Națională de Cercetare din Coreea http://dx.doi.org/10.13039/501100003725 grant finanțat de Guvernul Coreei (NRF-2011-0017315) (J.-SK).

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

Contribuțiile autorului. H.-J.L., S.-B.J., A.I.R., H.-J.L., M.-J.K. și S.-H.K. a contribuit la proiectarea experimentală, cercetarea, analiza datelor și revizuirea manuscrisului. R.S.K. și J.-S.K. a contribuit la proiectarea experimentală, analiza datelor și scrierea manuscrisului. R.S.K. și J.-S.K. sunt garanții acestei lucrări și, ca atare, au avut acces deplin la toate datele din studiu și își asumă responsabilitatea pentru integritatea datelor și acuratețea analizei datelor.

Prezentare prealabilă. Această lucrare a fost prezentată ca afiș la Conferința internațională a Societății Coreene pentru Biologie Moleculară și Celulară, Seul, Coreea, 9-11 octombrie 2013.