1 Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Diego, La Jolla, CA 92093, SUA

Abstract

1. Introducere

În 2009, am sugerat, pentru prima dată, să folosim peștele zebră ca organism model pentru a studia evenimente vasculare specifice relevante pentru dezvoltarea aterosclerozei umane [1]. Hrănirea peștilor zebra adulți cu o dietă bogată în colesterol (HCD) are ca rezultat hipercolesterolemie, colesterolul plasmatic total atingând 800 mg/dL, oxidarea profundă a lipoproteinelor și formarea de leziuni vasculare, asemănătoare dungilor de grăsime umane. Peștele zebră adult hrănit cu HCD a fost folosit de Cho și colegii săi pentru a studia efectele suplimentelor alimentare și îndulcitorilor asupra nivelului de colesterol plasmatic și asupra activității CETP [2-4]. Transparența optică a larvelor de pește zebră în primele 30 de zile după fertilizare (dpf) permite monitorizarea microscopică la animalele vii a acumulării de lipide vasculare, recrutarea celulelor mieloide, formarea celulelor de spumă macrofagă, dezorganizarea stratului de celule endoteliale și creșterea PLA2 vasculară activitate și permeabilitate vasculară - toate induse de o hrănire scurtă (5-14 zile) cu HCD [1, 5]. Mai mult, raportul nostru recent demonstrează aplicațiile unui transgenic hsp70: IK17-EGFP pește zebră, cu expresie condiționată a anticorpului conjugat EGFP IK17 specific LDL oxidat, în studiu in vivo oxidarea lipoproteinelor și în testarea efectelor terapeutice ale antioxidanților [5].

Deoarece hrănirea peștilor zebră cu HCD duce la o oxidare extinsă a lipoproteinelor, am caracterizat în continuare mediul lipidic oxidat în larvele alimentate cu HCD [6]. O hrănire cu HCD de 2 săptămâni a dus la creșteri de până la 70 de ori a nivelurilor de esteri de colesterol oxidați, fosfolipide oxidate și lizofosfolipide în omogenizații de pește zebră. În mod remarcabil, moleculele specifice de lipide oxidate detectate în larvele de pește zebră alimentate cu HCD folosind cromatografie lichidă-spectrometrie de masă au fost identice cu cele găsite în leziunile aterosclerotice umane și de șoareci [6]. Lipoproteinele izolate din larvele alimentate cu HCD au activat macrofagele de șoarece in vitro, cu modelul de fosforilare ERK1/2, JNK și Akt și răspândirea celulară similară cu cea indusă de LDL uman minim oxidat [6].

Astfel, munca noastră și munca altora sugerează că hipercolesterolemia și oxidarea lipoproteinelor obținute în peștele zebră și caracteristicile acumulării lipidelor vasculare și ale proceselor inflamatorii, relevante pentru aterogeneză umană, fac modelul zebră un atractiv in vivo sistem pentru testarea abordărilor terapeutice noi și studierea mecanismelor medicamentelor existente. Scopul prezentului studiu a fost de a investiga dacă simvastatina și ezetimibul, principalele medicamente utilizate pentru gestionarea hipercolesterolemiei la om, ar reduce, de asemenea, nivelul colesterolului în larvele de pește zebră alimentate cu HCD.

2. Materiale și metode

2.1. Întreținerea și hrănirea peștilor zebră

S-au obținut embrioni de pește zebră de tip sălbatic (AB) in vitro fertilizarea și reproducerea naturală a adulților menținută la 28 ° C pe un ciclu de lumină/întuneric de 14/10 ore și etapizată așa cum este descris [7]. Larvele de pește zebră au fost hrănite de două ori pe zi, începând cu a 5-a zi după fertilizare (dpf), fie cu dietă martor (Perle aurii, dimensiune 100-200 mm din Brine Shrimp Direct), fie cu HCD (colesterol 4% dizolvat în dietil eter adăugat la Golden Perle) timp de 14 zile, așa cum este descris în lucrarea noastră anterioară [1]. Toate studiile pe animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, San Diego.

2.2. Tratamentul cu Ezetimibe și Simvastatină
2.3. Extracția lipidelor din omogenate de pește zebră și măsurători ale colesterolului

La sfârșitul perioadei de hrănire/tratament, 20 de larve de pește zebră din fiecare grup experimental au fost eutanasiate prin expunere la 0,05% tricaină (Sigma). Au fost îndepărtate abdomenele care conțin alimente nedigerate, iar corpurile rămase au fost reunite și omogenizate ușor în 200 μL de PBS rece ca gheața într-un tub eppendorf folosind un pistil de plastic. După răsucirea resturilor de țesut, supernatantul reprezentând fluidele corpului a fost utilizat pentru analize suplimentare. Conținutul de proteine ​​din omogenizați a fost determinat folosind testul Bradford cu un kit de testare a proteinei BCA (Pierce). Lipida totală a fost extrasă din omogenatele de pește zebră așa cum am descris anterior [6]. Pe scurt, omogenatele tisulare au fost suplimentate cu 50 μg stigmasterol, un standard intern pentru controlul recuperării sterolilor extrasați. Extracția totală a lipidelor a fost efectuată cu metanol/diclormetan 1: 2. Esterii colesterolului au fost saponificați și colesterolul liber total și stigmasterolul au fost măsurați cu un cromatograf gazos Shimadzu GC-2014 folosind un

(i.d.) ZB-5HT coloană capilară inferioară, grosimea filmului 0,2 μm (Phenomenex). Standardele privind colesterolul și stigmasterolul au fost analizate în paralel cu probele experimentale.

2.4. Statistici

-testul a fost utilizat pentru a analiza diferențele dintre mediile a 2 grupuri.

a fost folosit ca prag de semnificație.

3. Rezultate si discutii

Am raportat anterior că nivelul colesterolului plasmatic la peștele zebră adult crește de la 200 la 800 mg/dL după 12 săptămâni de hrănire cu HCD. Larvele de pește zebră sunt prea mici pentru a extrage sânge. Astfel, am măsurat nivelurile de colesterol din fluidele corporale izolate din larvele din care abdominii au fost îndepărtați și corpurile rămase au fost ușor omogenizate. Omogenatele au fost centrifugate pentru a restrânge resturi de țesut și supernatanții au fost folosiți pentru extragerea lipidelor totale și măsurarea colesterolului utilizând o metodă de cromatografie cu gaze. O hrănire cu HCD de 2 săptămâni a dus la o creștere de 2,5 ori a nivelului de colesterol în larvele de pește zebră (Figura 1). Aceste rezultate sugerează că condițiile experimentale utilizate în experimentele cu larve de pește zebră raportate în lucrările noastre anterioare [1, 5, 6] conduc la creșteri semnificative ale nivelului colesterolului în fluidele corpului larvelor, comparabile cu hipercolesterolemia raportată pentru peștele zebră adult hrănit cu HCD [1].

larvele

Nivelurile totale de colesterol în larvele de pește zebră alimentate cu HCD. Larvele de pește zebră au fost alimentate cu diete de control sau cu conținut ridicat de colesterol începând cu al 5-lea dpf și au continuat timp de 14 zile. Nivelurile totale de colesterol sunt exprimate în μg colesterol per mg de proteină de lizat de larve.

din 6 experimente independente; 15-20 de larve au fost reunite pentru fiecare punct de date experimentale din fiecare experiment individual.

Pentru a studia efectul simvastatinei, am adăugat-o inițial direct în apă, așa cum a fost raportat în studii pe termen scurt [9]. Cu toate acestea, am constatat că o expunere prelungită la simvastatină în apă a fost toxică pentru larvele de pește zebră. Variația dozelor de simvastatină și a vârstei larvelor la începutul tratamentului nu a contribuit la îmbunătățirea supraviețuirii peștilor zebră. Apoi, am amestecat simvastatina în alimente pentru pești în doze cuprinse între 0,1 și 50 μg pe gram de alimente (μa/a). După cum se estimează în Metode, o doză de, de exemplu, 10 μg/g simvastatină administrată cu alimente de pește zebră este aproximativ un echivalent cu o doză de 50 mg simvastatină administrată pacienților umani. Așa cum se arată în Figura 2, aceste doze de simvastatină au fost mai puțin eficiente decât se așteptau din studiile pe termen scurt, fără nicio diferență semnificativă între grupul care a primit HCD singur și grupul care a primit HCD cu doze mai mari de simvastatină (

pentru 10 și 50 combinate μgrupul de simvastatină a/a). Deoarece farmacocinetica simvastatinei administrată cu alimente larvelor de pește zebră nu a fost explorată, aceste rezultate negative s-ar putea datora unei doze eficiente mici de simvastatină. Cu toate acestea, o doză mai mare este problematică, având în vedere toxicitatea simvastatinei adăugate în apă.


Efectul simvastatinei asupra nivelului de colesterol în larvele de pește zebră alimentate cu HCD. Larvele de pește zebră au fost hrănite cu HCD cu simvastatină amestecată în alimente de pește zebră la cantitățile indicate (μg simvastatină pe gram de alimente) timp de 14 zile. Colesterolul total a fost măsurat în extracte lipidice din omogenate de larve. Valorile colesterolului total per larvă au fost normalizate la valorile din grupul care a primit doar HCD (a doua coloană). Omogenatele a 20 de animale au fost reunite pentru fiecare punct de date din fiecare experiment individual. Experimente cu 0, 10 și 50 μg/g simvastatină au fost repetate de două ori, iar valorile medii din aceste două experimente sunt prezentate în grafic.

Spre deosebire de simvastatină, adăugarea ezetimibului în apă nu a afectat supraviețuirea larvelor, modelul lor de înot și nici aportul de alimente aparent. Pe baza intervalului de doze de ezetimib care a fost raportat că inhibă absorbția colesterolului intestinal în larvele de pește zebră [8], am testat 0,1-50 μM ezetimib adăugat în apă. Am constatat că ezetimibul a fost foarte eficient în reducerea nivelului de colesterol în larvele alimentate cu HCD (Figura 3). Deja la concentrația de 1 μM, ezetimibul a redus colesterolul la nivelurile observate în dieta de control alimentată cu larve (

pentru ipoteza care înseamnă „control” și „


Efectul ezetimibului asupra nivelului de colesterol în larvele de pește zebră alimentate cu HCD. Larvele de pește zebră au fost hrănite cu HCD timp de 14 zile. Ezetimibe a fost adăugat la concentrațiile indicate direct în apa din rezervorul de pește, iar apa a fost schimbată în fiecare zi. Colesterolul total a fost măsurat în extracte lipidice din omogenate de larve. Valorile colesterolului total per larvă au fost normalizate la valorile din grupul care a primit doar HCD (a doua coloană). Omogenatele a 20 de animale au fost reunite pentru fiecare punct de date din fiecare experiment individual. Experimente cu 0, 1 și 5 μM ezetimibul a fost repetat de trei ori, iar valorile medii din aceste trei experimente sunt prezentate în grafic.

La om, ezetimibul vizează proteina intestinală Niemann-Pick C1 asemănătoare C1 (NPC1L1). Domeniul care leagă ezetimibul în peștele zebră Npc1l1 este foarte omolog cu domeniul corespunzător din NPC1L1 uman, cu fenilalanină și metionină conservate necesare pentru legarea ezetimibului cu afinitate ridicată [8]. Larvele tratate cu 6,25-50 μM ezetimibul prezintă reduceri cu 25-75% a formării vezicii biliare și a fluorescenței intestinale derivate din colesterolul nitrobenzoxadiazol (NBD) [8]. Aceste date sugerează că mecanismul de inhibare a absorbției colesterolului intestinal de către ezetimib la peștele zebră este similar cu cel la om, dar nu au fost încă raportate dovezi directe ale implicării Npc1l1 în metabolismul colesterolului zebră vizat de ezetimib.

Apoi, am testat dacă un tratament combinat cu ezetimib (în apă) și simvastatină (în alimente) ar duce la reduceri mai mari ale nivelului de colesterol în larvele alimentate cu HCD. Concentrații de ezetimib de 1 și 5 μM, combinat cu 10 sau 50 μg/g simvastatină, colesterolul redus la niveluri mai scăzute decât tratamentele individuale cu ezetimib sau simvastatină (Figurile 4 (a), 4 (b) și 4 (c)), în timp ce combinațiile de concentrații mai mari de ezetimib cu simvastatină nu au avut niciun aditiv efect (figurile 4 (d), 4 (e) și 4 (f)). Astfel, chiar dacă simvastatina, în condițiile noastre experimentale, a avut un efect redus asupra nivelului de colesterol din larvele de pește zebră, combinațiile selectate de simvastatină cu ezetimib au produs un efect mai mare în reducerea nivelului de colesterol decât fiecare medicament singur.

Efectul tratamentelor combinate cu simvastatină și ezetimib asupra nivelului de colesterol în larvele de pește zebră alimentate cu HCD. Larvele de pește zebră au fost hrănite cu HCD timp de 14 zile. Simvastatina și ezetimibul au fost administrate așa cum este descris în legendele din Figurile 1 și 2. Colesterolul total a fost măsurat în extracte de lipide din omogenate de larve. Valorile colesterolului total per larvă au fost normalizate la valorile din grupul care a primit doar HCD (a doua coloană). Omogenatele a 20-40 de animale au fost reunite pentru fiecare punct de date din fiecare experiment individual.

Rețineți că, în mai multe experimente, tratamentele peștilor zebră alimentate cu HCD cu ezetimib sau cu o combinație ezetimib/simvastatină au redus nivelurile de colesterol de 4 ori mai mici decât în ​​peștele zebră care a primit dietă de control și nu a primit alt tratament (Figurile 3 și 4). Peștii folosesc preferențial lipide mai degrabă decât carbohidrați ca sursă de energie și ar fi clasificați, utilizând standarde aplicate mamiferelor, ca hiperlipidemice și hipercolesterolemice, chiar și atunci când își consumă dieta normală [10]. Tratamentele cu ezetimib și ezetimib/simvastatină au reușit să reducă hipercolesterolemia „normală” a peștilor zebră, fără efecte aparent dăunătoare asupra supraviețuirii larvelor, a modelului de înot sau a comportamentului de hrănire.

4. Concluzii

Alimentarea cu colesterol a larvelor de pește zebră a dus la creșteri de 2,5 ori ale nivelului de colesterol în fluidele corporale izolate din omogenizarea larvelor. Aceste rezultate sunt de acord cu constatările noastre anterioare privind creșterea nivelului de colesterol în plasmă la peștele zebră adult hrănit cu un HCD similar și sugerează că hrănirea cu HCD probabil induce hipercolesterolemie și în larve. Am constatat că ezetimibul este bine tolerat de larvele de pește zebră și reduce efectiv nivelurile de colesterol din larvele alimentate cu HCD la sau chiar sub nivelurile observate la animalele de control. În schimb, simvastatina adăugată în apă este slab tolerată de larvele de pește zebră și, atunci când este adăugată la alimente la dozele testate, are un efect redus asupra nivelului de colesterol din larvele alimentate cu HCD. Combinația de doze mici de ezetimib și simvastatină poate avea un efect aditiv în reducerea nivelului de colesterol din peștele zebră. Aceste rezultate sugerează că, similar efectului său terapeutic la om, ezetimibul reduce în mod eficient nivelul colesterolului în larvele de pește zebră alimentate cu HCD și poate fi utilizat în modelul de zebră hipercolesterolemică pentru a studia efectele sale asupra acumulării și inflamației lipidelor vasculare, proceselor relevante pentru patogeneza omului. ateroscleroza.

Mulțumiri

Studiul a fost susținut de Programul de studiu inițiat de investigator (IISP 38001) de la Merck, Inc. și NIH Grant HL093767.

Referințe

  1. K. Stoletov, L. Fang, S. H. Choi și colab., „Acumularea de lipide vasculare, oxidarea lipoproteinelor și absorbția lipidelor macrofage în peștii zebra hipercolesterolemici” Cercetarea circulației, vol. 104, nr. 8, pp. 952–960, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Scholar
  2. S. Jin, J. H. Hong, S. H. Jung și K. H. Cho, „Curcuma și extractele apoase de lauri prezintă in vitro activitate anti-aterosclerotică și in vivo efecte hipolipidemice într-un model de pește zebră " Journal of Medicinal Food, vol. 14, nr. 3, pp. 247–256, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Scholar
  3. S. Jin și K. H. Cho, „Extractele de apă din scorțișoară și cuișoare prezintă o inhibare puternică a glicației proteinelor și a activității anti-aterosclerotice in vitro și in vivo activitate hipolipidemică la peștele zebră " Toxicologie alimentară și chimică, vol. 49, nr. 7, pp. 1521–1529, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Scholar
  4. J. Y. Kim, J. Seo și K. H. Cho, „peștele zebră hrănit cu aspartam prezintă decese acute cu defecte de înot și peștele zebră hrănit cu zaharină are o creștere a activității proteinelor de transfer a esterilor colesterilici în hipercolesterolemie”. Toxicologie alimentară și chimică, vol. 49, pp. 2899–2905, 2011. Vezi la: Google Scholar
  5. L. Fang, S. R. Green, J. S. Baek și colab., „In vivo vizualizarea și atenuarea acumulării de lipide oxidate în peștii zebra hipercolesterolemici " Journal of Clinical Investigation, vol. 121, pp. 4861–4869, 2011. Vezi la: Google Scholar
  6. L. Fang, R. Harkewicz, K. Hartvigsen și colab., „Esterii colesterolului oxidat și fosfolipidele din larvele de pește zebră hrănite cu o dietă bogată în colesterol: legarea și activarea macrofagelor” Jurnalul de chimie biologică, vol. 285, nr. 42, pp. 32343–32351, 2010. Vizualizați la: Site-ul editorului | Google Scholar
  7. C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S. R. Kimmel, B. Ullmann și T. F. Schilling, „Etapele dezvoltării embrionare a peștilor zebră” Dinamica dezvoltării, vol. 203, nr. 3, pp. 253–310, 1995. Vizualizare la: Google Scholar
  8. J. D. Clifton, E. Lucumi, M. C. Myers și colab., "Identificarea inhibitorilor noi ai absorbției lipidelor dietetice folosind pește zebră" Plus unu, vol. 5, nr. 8, ID articol e12386, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Scholar
  9. L. S. Wen, K. Eng, J. Lee și P. McGrath, „Utilizarea unui anticorp monoclonal specific pentru celulele endoteliale activate pentru a cuantifica angiogeneza in vivo la peștele zebră după tratamentul medicamentos ” Angiogeneza, vol. 7, nr. 3, pp. 243–253, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Scholar
  10. P. J. Babin și J. M. Vernier, „Lipoproteinele plasmatice la pește” Journal of Lipid Research, vol. 30, nr. 4, pp. 467–489, 1989. Vezi la: Google Scholar