Nicolas Smadja-Lamère

De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,

Michael Shum

De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,

Paul Déléris

§ Institutul de Cercetare în Imunologie și Cancer (IRIC) și

Philippe P. Roux

§ Institutul de Cercetare în Imunologie și Cancer (IRIC) și

¶ Departamentul de patologie și biologie celulară, Facultatea de Medicină, Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec H3C 3J7, Canada și

Jun-Ichi Abe

Centrul Medical ‖ Universitatea din Rochester, ACVRI, New York 14642

André Marette

De la Institutul de inimă și plămâni din Quebec, Universitatea Laval, 2705 Chemin Ste-Foy, Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, Canada,

Abstract

Introducere

Aici, descriem o nouă buclă de feedback negativ prin care insulina activează RSK, care promovează fosforilarea IRS-1 pe Ser-1101, independent de calea mTOR/S6K1. La rândul său, aceasta restricționează semnalizarea insulinei și metabolismul glucozei în mușchii scheletici și celulele hepatice.

PROCEDURI EXPERIMENTALE

Reactivi și anticorpi

DMSO, gelatina de pește și rapamicina provin de la Sigma-Aldrich. BI-D1870 provine din complexul MSI/WTB de la Universitatea din Dundee, Marea Britanie. PF-4708671 era de la Symansis (Timaru, NZ). Insulina a fost de la Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). Anticorpii anti-IRS1, anti-G6Pase, anti-PGC1α și anti-RSK provin de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-phospho-RSK Ser-221 și Ser-380 provin de la Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfo-IRS-1 Ser-1101 și Ser-636/9; anti-phospho-S6K1 Thr-389, anti-phospho-GSK3 Ser-21/9, anti-GSK3, anti-phospho-Foxo Ser-256, anti-Foxo, anti-phospho-mtor Ser- 2448 și anti-AKT Ser-473 provin de la Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Antitubulina a fost de la Sigma-Aldrich. Anticorpul p85 a fost de la Millipore (San Francisco, CA). Anti-PEPCK a fost de la Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Adenovirusurile dominante RSK1 (RSK1-DN) și LacZ au fost deja descrise (22).

Cultură de celule

Mioblastele L6 au fost crescute în α-MEM (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS și diferențiate în miotuburi în α-MEM cu 2% FBS așa cum s-a descris anterior (27). Celulele HepG2 au fost crescute în DMEM (Invitrogen). Celulele L6 și HepG2 au fost private de ser timp de 4 ore înainte de experiment și s-a utilizat insulină de 100 nm pentru a stimula celulele în ultima oră de privare. Hepatocitele FAO au fost menținute în mediile RPMI (Invitrogen). Celulele FAO au fost lipsite de ser peste noapte și stimulate cu concentrația indicată de insulină.

Analize occidentale

Western blot au fost efectuate așa cum este descris (23). Pe scurt, cantități egale de proteine ​​au fost separate prin SDS-PAGE (9%) și transferate pe membrane de nitroceluloză. Membranele au fost blocate în gelatină de pește 5% diluată în PBS, pH 7,4, 0,1% Tween (PBS-T) și incubate peste noapte cu anticorpii respectivi diluați în 1% gelatină de pește în PBS-T. Imunoprecipitările au fost efectuate așa cum s-a descris cu modificări minore (24). Lizatele celulare totale (500 μg) au fost pre-curățate cu proteina A-Sepharose și imunoprecipitate cu anticorpii relevanți cuplați cu proteina A-Sepharose.

2-Deoxiglucoză (2-DG)

Au fost utilizate procedurile de absorbție 2-DG așa cum s-a descris anterior (25). Pe scurt, celulele au fost incubate timp de 8 minute în soluție salină tamponată HEPES conținând 10 μm 2-DG nemarcat și 10 μm d -2-deoxi- [3H] glucoză (0,5 μCi/ml). Reacția a fost terminată prin spălare de trei ori cu NaCl răcit cu gheață 0,9% (g/v). Radioactivitatea asociată celulei a fost determinată prin lizarea celulelor cu 0,05 N NaOH, urmată de numărarea scintilației lichide și normalizată la concentrația de proteine.

Analize ale proteinelor fosfotransferazei
Producția de glucoză

Celulele FAO au fost incubate timp de 16 ore în mediu fără ser, cu sau fără insulină (100 n m). Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS și incubate cu mediu DMEM fără fenol și glucoză suplimentat cu 20 m m l-lactat de sodiu și 2 m m piruvat de sodiu timp de 5 ore cu sau fără insulină. Supernatanții celulari au fost colectați și concentrația de glucoză a fost măsurată cu setul de testare Amplex-Red Glucose în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Invitrogen). Celulele au fost lizate cu 50 m m NaOH și concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un kit de testare a proteinei BCA pentru a normaliza producția de glucoză.

Cuantificare și analize statistice

Western blot a fost cuantificat cu versiunea software Quantity One 4.6.9 (Bio-Rad). ANOVA unidirecțional cu Boneferonni sau Tuckey post-hoc și testele t au fost efectuate cu GraphPad Prism versiunea 5.0a pentru Mac (Software GraphPad).

REZULTATE

O kinază insensibilă la rapamicină fosforilează IRS-1 la concentrații normale de AA

Așa cum s-a arătat anterior (4), insulina stimulează fosforilarea IRS-1, în principal printr-o kinază sensibilă la rapamicină în condiții de supraîncărcare a nutrienților, cum ar fi un exces de AA (vezi schimbarea moleculară IRS-1 prevenită de rapamicină în condiții de 2 × AA, Fig. 1 A). Cu toate acestea, la concentrații scăzute până la normale de aminoacizi (0-1 × AA), rapamicina a avut doar efecte minore asupra deplasării moleculare superioare induse de insulină a IRS-1, sugerând că mTORC1/S6K1 nu este responsabil pentru deplasarea mobilității. Aceste rezultate indică, de asemenea, că alte kinaze ar putea fosforila IRS-1 în absența supraîncărcării AA (vezi condițiile 0-1 × AA, Fig. 1 A). Pe aceeași linie, fosforilarea RSK nu este afectată de concentrații diferite de aminoacizi sau rapamicină (Fig. 1 A).

activează

RSK1 fosforilează IRS-1 pe Ser-1101

La analiza secvenței de aminoacizi a IRS-1, am observat că mediul peptidic din jurul Ser-1101 este conservat pe tot parcursul evoluției și corespunde motivului de tip 1 de fosforilare prezent în multe substraturi RSK (RXRXX-pS/T-XXX, vezi legenda figurii pentru detalii; Fig. 1, B și C). Am căutat apoi în secvența IRS-1 umană prezența acestui motiv consens și am găsit 5 resturi de serină supuse IRS-1 prezente în motivul fosforilării RSK (Fig. 1 D).

În continuare, am căutat să determinăm dacă RSK ar putea fosforila IRS-1 Ser-1101 în celule mai tipice orientate spre insulină. Liniile celulare L6 (miocite de șobolan) și HepG2 (hepatocite umane) au fost înfometate cu ser timp de 4 ore și tratate cu insulină de 100 n m. Activarea RSK a fost apoi evaluată prin Western blot folosind anticorpi direcționați împotriva reziduurilor fosfo-Ser-221 sau fosfo-Ser-380 ale RSK, ultimii pași în mecanismul care duc la activarea RSK (16). Am constatat că RSK este activat de insulină într-o manieră dependentă de timp în miocitele L6 (Fig. 2 A) și în celulele hepatice HepG2 (Fig. 2 B). Mai mult, RSK a fost activat de insulină cu o cinetică similară cu cea a mTOR și S6K1, după cum s-a relevat prin fosforilarea proteinei S6 în celulele musculare (Fig. 2 A) sau a proteinelor mTOR și S6K1 în celulele hepatice (Fig. 2 B).

RSK fosforilează IRS-1 Ser-1101 Independent de mTORC1/S6K1

Pentru a distinge rolul RSK și mTOR în fosforilarea Ser-1101 și Ser-636/9, am tratat și celulele L6 în ultima oră de privare cu BI-D1870, un inhibitor farmacologic al RSK (29) sau inhibitorul mTORC1, rapamicină. Am folosit 10 μm BI-D1870, deoarece această doză a fost necesară pentru a inhiba fosforilarea RSK Ser-221, precum și fosforilarea substratului RSK S6 (Fig. 3 A). Este, de asemenea, doza necesară pentru a reduce fosforilarea IRS-1 pe Ser-1101 de către RSK (Fig. 3 A). În celulele L6 tratate cu vehicul (DMSO), stimularea cu insulină a crescut semnificativ fosforilarea atât a Ser-1101, cât și a Ser-636/9 (Fig. 3 B). Cu toate acestea, tratamentul cu BI-D1870 a inhibat selectiv și semnificativ fosforilarea Ser-1101 fără a bloca fosforilarea reziduurilor Ser-636/9 (Fig. 3 B). Aceste rezultate sunt în acord cu analizele noastre bioinformatice, care nu au prezis fosforilarea Ser-636/9 de către RSK (vezi Fig. 1 D). Pe de altă parte, tratamentul cu rapamicină a atenuat semnificativ doar fosforilarea reziduurilor IRS-1 Ser-636/9 în celulele L6 tratate cu insulină în condiții normale de aminoacizi așa cum am observat anterior (4) (Fig. 3 B, panoul inferior).

Deoarece 10μ m BI-D1870 a scăzut fosforilarea Ser1101 a IRS-1 (Fig. 3, A și B), am testat apoi impactul acesteia asupra semnalizării insulinei din aval în celulele musculare utilizând fosforilarea Akt Ser-473 ca citire moleculară. Tratamentul BI-D1870 nu a avut ca rezultat creșterea așteptată a fosforilării Akt, în ciuda efectului medicamentului asupra inhibitorilor boli ai fosforilării IRS-1 pe Ser-1101 (Fig. 3 D). Cu toate acestea, a fost raportat anterior că BI-D1870 inhibă parțial acțiunea insulinei prin inhibarea fosforilării Akt în celulele 3T3-L1, sugerând o acțiune în afara țintei acestui inhibitor atunci când este utilizat la 10 μm (31). Ne-am îndreptat astfel către o abordare genetică pentru a inhiba activitatea RSK, folosind un mutant negativ dominant al RSK1 (RSK1-DN) care a fost exprimat în miocitele L6 folosind un vector adenoviral (22). Așa cum era de așteptat, în celulele de control care exprimă LacZ, insulina a stimulat în mod semnificativ fosforilarea Ser-1101 (Fig. 4 A, bare negre), în timp ce în celulele care exprimă RSK1-DN, insulina nu a putut crește nivelurile de fosforilare ale acestui reziduu (Fig. 4 A, bare albe). Cu toate acestea, în condiții similare, Ser-636/9 IRS-1 a rămas fosforilat de insulină (Fig. 4 A).

Inhibarea activității RSK îmbunătățește efectele metabolice ale insulinei

Am arătat anterior că fosforilarea IRS-1 pe Ser-1101 contribuie la inhibarea semnalizării insulinei la nivelul PI3K/Akt (9). Astfel, am evaluat asocierea subunității p85 a PI3K la IRS-1 în celulele musculare care exprimă fie RSK1-DN, fie LacZ. S-au utilizat cantități saturate de anticorp pentru a imunoprecipita IRS-1 urmat de analiza Western blot. Datele arată că stimularea insulinei a crescut asocierea p85 cu IRS-1 în celulele de control (LacZ, bazal versus insulină; Fig. 4 B), iar acest răspuns este crescut în continuare în miocitele care exprimă RSK1-DN. Mai mult, s-a constatat că expresia RSK1-DN îmbunătățește fosforilarea Akt indusă de insulină, care a fost semnificativă statistic pentru Ser-473, dar nu pentru situl Thr-308, în comparație cu controalele infectate cu LacZ (Fig. 4 C).

Am evaluat apoi dacă reglarea în creștere a semnalizării insulinei către PI3K/Akt prin expresia RSK1-DN are un impact funcțional asupra metabolismului glucozei musculare prin măsurarea captării de 2-deoxid-3 - glucoză mediată de insulină în miocitele L6. Cu trei zile înainte de experimentare, miocitele L6 în mediile de diferențiere au fost infectate cu adenovirusuri care codifică fie RSK1-DN sau LacZ ca control. Celulele au fost apoi înfometate cu ser timp de 4 ore și tratate cu insulină de 100 n m în ultimele 45 de minute și s-a măsurat absorbția glucozei (25). Așa cum se arată în FIG. 4 D, insulina a indus o creștere de 1,7 ori a absorbției glucozei, care a fost crescută în continuare la 2,5 ori prin expresia constructului RSK1-DN comparativ cu celulele bazale care exprimă LacZ. Aceste rezultate sunt în concordanță cu ipoteza că activitatea RSK este un inhibitor al acțiunii metabolice a insulinei în mușchiul scheletic.

Pentru a determina dacă RSK controlează și acțiunea insulinei în ficat, am evaluat apoi dacă inhibarea RSK îmbunătățește suprimarea gluconeogenezei mediată de insulină în celulele hepatice FAO. La trei zile după infecția cu adenovirusurile LacZ sau RSK1-DN, celulele hepatice au fost lipsite de ser și apoi stimulate cu concentrațiile de insulină indicate timp de 16 ore, urmate de incubare într-un mediu care conține lactat și piruvat ca singură sursă de carbon și creșterea concentrațiilor de insulină. . S-a determinat apoi glucoza produsă din aceste substraturi gluconeogene. În controlul celulelor care exprimă LacZ, am observat o inhibare dependentă de doză a producției de glucoză de către insulină (Fig. 5 A). Cu toate acestea, în celulele FAO care exprimă constructul RSK1-DN, acțiunea supresivă a insulinei asupra producției de glucoză a fost semnificativ potențată la mai multe doze, indicând o îmbunătățire a sensibilității la insulină hepatică la inhibarea RSK.

Inhibarea activității RSK1 îmbunătățește sensibilitatea la insulină în hepatocite. A, hepatocitele FAO au fost infectate cu un adenovirus care codifică un mutant RSK1 negativ dominant (RSK1-DN) sau controlul genei LacZ timp de 72 de ore și a fost procesat pentru determinarea producției de glucoză (a se vedea „Proceduri experimentale” pentru detalii). Rezultatele sunt prezentate în pliuri peste bazale (LacZ) și reprezintă media ± S.E. din șase experimente independente. *, p m insulină în ultimele 45 de minute. Imunoprecipitarea IRS-1 a fost efectuată ca în Fig. 4 B. C, cantități egale de proteine ​​au fost separate pe SDS-PAGE și prelucrate pentru analize Western blot utilizând anticorpii indicați pentru a evalua semnalizarea insulinei și (D) expresia enzimei gluconeogene. Nivelurile de tubulină au fost utilizate ca controale de încărcare. Aceste pete sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente separate.

Constatarea noastră că inhibarea autologă mediată de RSK a semnalizării insulinei este probabil implicată în reglarea fiziologică a acțiunilor metabolice ale insulinei nu exclude faptul că aceasta poate fi implicată și în dezvoltarea rezistenței la insulină. Într-adevăr, am constatat că interferarea cu activitatea RSK1 nu numai că a potențat răspunsul fiziologic la insulină, ci și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină într-un model bine cunoscut de rezistență la insulină indusă de expunerea cronică la insulină cu conținut ridicat de glucoză în miocitele L6. Aceste date sunt în concordanță cu ipoteza că RSK promovează rezistența la insulină prin creșterea fosforilării IRS-1 Ser-1101 atenuând astfel activarea semnalizării PI3K/Akt, un mecanism de feedback negativ care este împărțit de S6K1 pentru a promova rezistența la insulină la excesul de nutrienți (9).

Luate împreună, rezultatele noastre demonstrează că RSK este implicat în reglarea negativă a IRS-1 prin capacitatea sa de a fosforila direct Ser-1101, independent de excesul de nutrienți și de activarea mTORC1/S6K1. Utilizarea unui mutant RSK1-DN ne-a permis în continuare să demonstrăm un rol funcțional pentru RSK1 ca un regulator negativ al metabolismului glucozei în celulele musculare și hepatice, prin fosforilarea IRS-1 Ser-1101 și inhibarea semnalizării PI3K/Akt. Descoperirile noastre conform cărora RSK1 mediază rezistența la insulină în celulele musculare tratate cu HG/HI sugerează în plus că RSK este o nouă țintă potențială pentru tratamentul rezistenței la insulină, cel puțin in vitro. Vor fi necesare studii viitoare pe modele animale lipsite de izoforme RSK individuale în țesuturile metabolice cheie pentru a înțelege pe deplin rolul fiecărui membru al acestei familii de kinase Ser/Thr în reglarea acțiunii insulinei în stările fiziologice și patologice.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Kerstin Bellmann și Dr. Patricia Mitchell pentru evaluarea critică a manuscrisului.