Abstract

fundal

Deși importanța proteinelor din matricea organică biominerală și modificările lor posttranslaționale pentru biomineralizare este în general recunoscută, numărul proteomilor matriciali publicați este încă mic. Acest lucru se datorează în mare parte lipsei unei secvențe cuprinzătoare de baze de date, derivate de obicei din proiecte de secvențiere genomică. Cu toate acestea, analiza proteomică bazată pe spectrometrie de masă, care depinde în mod critic de baze de date de secvență de înaltă calitate, este un instrument foarte rapid pentru identificarea candidaților pentru proteinele funcționale ale matricei biominerale și modificările lor posttranslaționale. Identificarea acestor proteine ​​candidate este facilitată de cuantificarea cel puțin aproximativă a proteinelor identificate, deoarece cele mai abundente pot fi, de asemenea, cei mai interesați candidați pentru analize funcționale ulterioare.

Rezultate

Recuantificarea celor identificate anterior Lottia proteinele matricei shell utilizând metoda cuantificării absolute bazate pe intensitate (iBAQ), implementată în software-ul de identificare și cuantificare MaxQuant, au arătat că doar 57 din 382 de identificări acceptate au constituit 98% din proteomul matricei identificat total. Acest grup de proteine ​​nu conținea proteine ​​intracelulare evidente, cum ar fi componentele cito-scheletice sau proteinele ribozomale, identificate invariabil ca fiind componente minore ale proteomilor cu matrice biominerală de mare viteză. Paisprezece dintre aceste proteine ​​majore au fost fosforilate într-o măsură variabilă. Toți împreună am identificat 52 de situri fosfo în 20 din cele 382 de proteine ​​acceptate cu încredere ridicată.

Concluzii

Arătăm că cuantificarea iBAQ poate fi un instrument util pentru restrângerea grupului de candidați funcționali ai proteinelor cu matrice biominerală pentru cercetări ulterioare în biologia celulară, genetică sau cercetarea materialelor. Cunoașterea modificărilor posttranslaționale în aceste proteine ​​majore ar putea fi un plus valoros pentru proteomii publicați anterior. Acest lucru este valabil mai ales pentru fosforilare, deoarece s-a demonstrat deja că această modificare modifică procesele de mineralizare în unele cazuri.

Introducere

Genomurile recent publicate ale organismelor biomineralizante permit analiza pe bază de spectrometrie de masă cu randament ridicat a proteomilor și fosfoproteomilor biominerali, facilitând astfel identificarea rapidă a fosfoproteinelor și a siturilor de fosforilare [15, 16]. În prezentul studiu adăugăm fosfoproteomul Lottia gigantea matrice shell la cea recent publicată Lottia proteomi de coajă [17, 18]. Mai mult, am re-cuantificat Lottia proteome shell folosind metoda iBAQ (cuantificare absolută bazată pe intensitate) [19] așa cum a fost implementată în MaxQuant. Acest lucru a arătat că 57 de proteine ​​reprezintă 98% din proteomul total identificat. Sugerăm că cuantificarea permite identificarea proteinelor majore, care sunt cei mai probabili candidați la proteinele funcționale din coajă, păstrând în același timp informații despre proteinele minore, indiferent dacă aceste proteine ​​minore joacă sau nu un rol în mineralizare sau nu, și indiferent dacă acestea apar - sau extracristalin.

Materiale și metode

Pregătirea matricei și a fosfopeptidelor

Fosfopeptidele s-au îmbogățit prin legare reversibilă la mărgele TiO2 (Titansphere 10 μm, GL Sciences, Japonia) în urma protocoalelor stabilite [21], dar înlocuind acidul 2,5-dihidroxibenzoic în tamponul de încărcare cu 6% acid trifluoroacetic (TFA) [22]. Pe scurt, margelele au fost spălate mai întâi în 80% acetonitril conținând 0,1% TFA (tampon de spălare), apoi în 80% acetonitril care conține 6% TFA (tampon de legare). Peptidele s-au dizolvat în tampon de legare (200 ul/peptide cu matrice de 2 mg) și s-au adăugat la aproximativ 5 mg de margele de TiO2 peletate slab. Amestecul a fost incubat pe o roată rotativă timp de 45 de minute. După centrifugare, supernatantul a fost din nou incubat cu margele proaspete de TiO2 ca înainte. Margelele au fost apoi spălate de două ori cu 200 pl de tampon de legare urmat de 2 × 200 pl de tampon de spălare. În cele din urmă, bilele încărcate au fost umplute în vârfuri de etapă C8 și fosfepteptidele au fost eluate cu 2 × 100 pl dintr-o soluție conținând 40% acetonitril și 15% amoniac. Eluatul a fost uscat sub vid într-un concentrator Eppendorf la

20 μl și acidulat cu TFA. Peptidele au fost purificate pe vârfurile etapei C18 [23] după diluarea la 200 μl cu acid acetic 0,5%.

Analiza LC-MS

Probele îmbogățite cu fosfopeptide au fost analizate pe un spectrometru de masă Q Exactive de înaltă performanță Quadrupole Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania) [24] conectat la un sistem HPLC Easy-nLC 1000 nanoflow (Thermo Fisher Scientific). Peptidele au fost separate pe o coloană de 50 cm cu un diametru interior de 75 μm umplut cu margele C18 de 1,8 μm (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Germania) preparate după cum este descris [25]. Peptidele au fost eluate cu acetonitril în acid formic 0,1% folosind un gradient de 5-30% acetonitril în 95min, 30-60% în 30 min și 60-95% în 8 min la un debit de 250 nl/min și o temperatură a coloanei de 50 ° C [25]. Spectrele de masă au fost achiziționate într-o manieră dependentă de date prin comutarea automată între MS și MS/MS într-o abordare de top 10. Rezoluția a fost de 70000 pentru spectrele complete și de 17500 (ambele la m/z 200) pentru fragmentele derivate din HCD. Timpul de excludere dinamic a fost de 30 sec.

Analiza datelor

Căutările de similitudine de secvență au fost efectuate cu FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/) [33] împotriva versiunilor actuale ale Uniprot Knowledgebase (UniProtKB). Alte instrumente de bioinformatică utilizate au fost Clustal Omega pentru alinierea secvențelor (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) [34], InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro) [35] pentru predicțiile domeniului și SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) [36] pentru predicția secvenței de semnal. Compoziția aminoacizilor și pI teoretic au fost determinate folosind instrumentul ProtParam furnizat de serverul Expasy (http://web.expasy.org/protparam/) [37]. Structura proteinelor cu tulburări intrinseci a fost prevăzută folosind IUPred (http://iupred.enzim.hu/) [38] și metodele furnizate de serverul PredictProtein 2013 (https://www.predictprotein.org/) [39, 40]. Categoriile GO pentru localizarea subcelulară au fost derivate din UniProt și Lottia intrări în baza de date, predicții ale secvenței de semnal și similaritate cu proteinele cunoscute.

rezultate si discutii

Reanaliza și recuantificarea proteinelor din coaja Lottia cu iBAQ implementat de MaxQuant

Rezultatele acestei noi căutări (fișier suplimentar 1: Tabelul S1) include acum toate proteinele publicate de [18] și conține 496 proteine ​​/ grupe de proteine. Dintre acestea, au fost acceptate 382 identificări de proteine ​​/ grupuri de proteine ​​(fișier suplimentar 2: Tabelul S2) conform regulilor enunțate în secțiunea Materiale și metode. Douăzeci și trei de proteine ​​au fost identificate numai în baza de date AllModels sau în combinație cu intrările UniProt, inclusiv câteva foarte abundente (Tabelul 1). Multe grupuri conțineau mai multe intrări AllModels care mărturisesc redundanța ridicată din această bază de date. Tabelul MaxQuant corespunzător cu date despre proteine ​​este conținut în fișierul suplimentar 1 (Fișierul suplimentar 1: Tabelul S1), care include și identificări neacceptate. Acestea au fost, de exemplu, identificări cu o singură peptidă cu scoruri scăzute sau acoperire insuficientă a secvenței. Datele peptidice ale celor peste 4000 de peptide unice în secvență, inclusiv secvențele peptidice și scorurile, sunt prezentate în fișierul suplimentar 3 (Fișierul suplimentar 3: Tabelul S3).

gigantea

Alinierea EFCB2 la secvențe similare. Secvențele acoperite de peptide secvențiate MS/MS sunt prezentate în roșu. Barele din secvența Lotgi1 | 239519 indică o inserție între peptida semnal și secvența asemănătoare EFCB2 care nu apare în celelalte intrări. Toate intrările afișate au făcut parte din grupurile de proteine ​​care conțin alte secvențe similare datorită redundanței ridicate a bazei de date AllModels.

În acord cu un studiu anterior [18], proteinele majore cuprindeau trei proteine ​​asemănătoare peroxidazei (Tabelul 1), inclusiv cea mai abundentă proteină Lotgi | 162078/DGLSP_LOTGI. Peroxidazele sunt o familie largă și larg răspândită de enzime care catalizează reacțiile redox folosind o varietate de donatori și acceptori de electroni, inclusiv molecule organice. Peroxidazele au fost implicate anterior în formarea cojilor de moluște [43]. Este posibil să fie responsabili de sclerotizarea periostracului [44-46], un strat proteic care limitează cavitatea mantalei înainte de începerea mineralizării. Așa cum s-a discutat anterior [18], se poate face ipoteza că peroxidazele funcționează în stabilizarea matricii nou secretate prin reticularea unora dintre componentele sale. O altă proteină majoră, a cărei abundență a fost observată doar folosind baza de date AllModels, deoarece FilteredModels conținea doar un fragment mic, a fost Lotgi1 | 166131. În această proteină, o întindere lungă de secvență cu structură dezordonată prevăzută este urmată de un domeniu de superoxid dismutază prevăzut. Superoxidul dismutaze este o familie de enzime cu distribuție subcelulară pe scară largă care elimină superoxidul, un metabolit aerob normal. Un produs de reacție al superoxidului dismutaze este H2O2, un substrat al peroxidazelor.

Uneori domeniile prezise indică puternic implicarea proteinei respective în evenimente de biomineralizare. Anhidrazele carbonice putative codificate în Lotgi | 238082/CAH1 și Lotgi | 239188/CAH2 și discutate anterior [18] pot fi importante pentru livrarea ionilor de carbonat. De asemenea, sunt de interes special proteinele care conțin domenii care leagă chitina, cum ar fi Lotgi1 | 226726, 228264 și 239574. Multe cochilii de moluște conțin schele extracristaline pe bază de chitină și proteinele care leagă chitina pot fi importante pentru organizarea acestor schele sau pot media interacțiunile între chitină și matricea calcificată [50]. Cu toate acestea, pentru majoritatea proteinelor matrice de coajă dovedite și supuse, funcția rămâne necunoscută în prezent.

Fosfoproteomul

Ținând cont de numărul de situri de fosforilare și de ocuparea sitului, CCD1/B3A0Q3 poate fi considerat ca fosforoproteina majoră a Lottia gigantea matrice de coajă. Vrem să subliniem, totuși, că proteinele dens fosforilate cu secvențe foarte repetitive, precum fosforina dentinică, care conține aproape exclusiv acid aspartic, asparagină și fosfoserină [2], necesită identificarea unor tehnici speciale și pot lipsi din analiza noastră.

O căutare a secvențelor incluzând site-uri fosfo pentru motive kinazice cunoscute a indicat faptul că aproximativ o treime (16 din 46) dintre siturile fosfo S/T unice sunt conforme cu site-ul de recunoaștere Fam20C SxE sau cu motive asociate (S/TxE/D/pS/pT) [3, 4]. Acest procent este în acord cu aproximativ 24% din fosfoproteine ​​secretate uman modificate la serina motivului S-x-E canonic FAM20C [6]. Cu toate acestea, se știe mult mai puțin despre fosforilarea proteinelor secretate de nevertebrate și a kinazelor implicate. Prin urmare, nu se știe dacă aceste site-uri de recunoaștere sunt conservate între vertebrate și nevertebrate. Cinci dintre siturile identificate sunt în acord cu motivul tipic cazeinei kinazei 2 SxxE modificat, de asemenea, în proteina osteopontină care inhibă mineralizarea mamiferelor și zece situri sunt conforme cu motivul cazeinei kinazei 1 (D/E) nxxS/T [1] indicând că sunt implicate kinaze secretate sau legate de membrană cu activitate asemănătoare cazeinei-kinazei. Dovezile pentru astfel de kinaze sunt rezumate în [5, 6].

Concluzii