Rezumat vizual

Declarație de semnificație

Dovezi considerabile indică faptul că canalul de potasiu rectificat în interiorul basolateral Kir4.1/Kir5.1 este esențial pentru transportul membranei în tubul distal convolut (DCT) și că sodiul și potasiul din dietă sunt importante în reglarea activității cotransportatorului Na-Cl sensibil la tiazidă. (NCC). În studiile la șoareci, autorii au descoperit că stimularea NCC indusă de restricția de sodiu a fost asociată cu creșterea activității Kir4.1/Kir5.1 în DCT și hiperpolarizarea membranei; Inhibarea NCC indusă de aportul ridicat de sodiu a fost asociată cu scăderea activității Kir4.1/Kir5.1 în DCT și depolarizarea membranei. La șoarecii knock-out Kir4.1 specifici rinichilor, efectul sodiei dietetice asupra activității NCC a fost în mare parte abolit, la fel ca efectele sale asupra conductanței și potențialului membranei DCT. Constatările indică faptul că Kir4.1/Kir5.1 este esențial pentru medierea aportului de sodiu din dietă - indusă de modularea funcției NCC.

esențială

Abstract

fundal Aportul dietic de sodiu reglează cotransportorul Na-Cl (NCC) sensibil la tiazidă din tubul contort distal (DCT). Nu este cunoscut dacă canalul de potasiu bazolateral, rectificat interior Kir4.1/Kir5.1 (un heterotetramer al Kir4.1/Kir5.1) în DCT este esențial pentru medierea efectului aportului de sodiu din dietă asupra activității NCC nu este cunoscut.

Metode Am folosit electrofiziologie, tehnici de eliminare renală și imunoblotare pentru a examina efectele Kir4.1/Kir5.1 în DCT și NCC la șoareci knockout Kir4.1 de tip sălbatic și renal.

Rezultate Aportul scăzut de sodiu a stimulat activitatea Kir4.1/Kir5.1 basolaterală, a crescut conductanța K + basolaterală și a hiperpolarizat membrana. În schimb, aportul ridicat de sodiu a inhibat canalul de potasiu, a scăzut curenții bazolaterali K + și a depolarizat membrana. Aportul scăzut de sodiu a crescut expresia NCC totală și fosforilată și natriureza crescută indusă de hidroclorotiazidă; aportul mare de sodiu a avut efecte opuse. Astfel, activitatea NCC crescută indusă de aportul scăzut de sodiu a fost asociată cu reglarea în sus a activității Kir4.1/Kir5.1 în DCT, în timp ce inhibarea activității NCC prin aportul ridicat de sodiu a fost asociată cu diminuarea activității Kir4.1/Kir5.1. În schimb, aportul dietetic de sodiu nu a afectat activitatea NCC la șoarecii knockout. Mai mult, ștergerea Kir4.1 nu numai că a abolit conductanța K + basolaterală și a depolarizat membrana DCT, dar a abrogat și efectele stimulatoare induse de aportul scăzut de sodiu asupra conductanței K + basolaterale și a hiperpolarizării. În cele din urmă, aportul de sodiu din dietă nu a modificat rata de excreție urinară a potasiului la eliminarea hipokalemică și la șoarecii de tip sălbatic.

Concluzii Stimularea Kir4.1/Kir5.1 prin aport scăzut de sodiu din dietă este esențială pentru reglarea crescută a NCC, iar inhibarea Kir4.1/Kir5.1 indusă de aportul ridicat de sodiu este un pas cheie pentru reglarea descendentă a NCC.

Tubulul distal convoluit (DCT) este responsabil pentru reabsorbția a 5% din sarcina de Na + filtrată și este ținta pentru diureticele tiazidice. 1-4 Reabsorbția NaCl în DCT este un proces în doi pași (Figura suplimentară 1A): Na + și Cl - intră în celulele din membrana apicală prin cotransportorul Na-Cl (NCC) și Na + este apoi pompat a celulei prin Na-K-ATPaza bazolaterală, în timp ce Cl - iese din celulă de-a lungul gradientului său electrochimic prin canale bazolaterale Cl - (ClC-kb) sau cotransportorul KCl. 5-7 În partea târzie a DCT (DCT2), Na + intră în celulă prin membrana apicală atât prin NCC, cât și prin ENaC. 8-10 Deși NCC este exprimat în membrana apicală, canalul de potasiu rectificat interior (Kir) 4.1 este exprimat în membrana basolaterală a DCT. 11,12 În plus, Kir4.1 este singurul canal K + care furnizează conductanța K + basolaterală în DCT. 13 Un număr mare de dovezi indică faptul că Kir4.1 basolateral în DCT este esențial pentru transportul membranei în DCT. 13-16 Mutațiile pierderii funcției Kir4.1 la rinichi afectează în principal transportul membranei în DCT. 17-19 Rolul Kir4.1 în medierea transportului membranei în DCT este recapitulat la șoarecii Ks-Kir4.1 knockout cu irosire ușoară de sare, alcaloză metabolică și hipokaliemie datorată inhibării activității NCC. 15

Un număr mare de dovezi au demonstrat în mod convingător că aportul dietetic de Na + și K + joacă un rol important în reglarea activității NCC: aportul scăzut de potasiu sau sodiu scăzut (LS) stimulează în timp ce aportul ridicat de potasiu sau sodiu ridicat (HS) inhibă activitatea NCC . 14-16,20-23 În plus, experimentele noastre anterioare au demonstrat că Kir4.1 joacă un rol cheie în medierea efectului aportului de K + din dietă asupra NCC, deoarece ștergerea Kir4.1 a abolit complet efectul aportului de K + din dietă NCC. 16 Astfel, ridică posibilitatea dacă Kir4.1 din DCT este, de asemenea, implicat în medierea efectului aportului de Na + din dietă asupra NCC sensibil la tiazidă. Prin urmare, scopul acestui studiu este de a testa ipoteza că stimularea NCS indusă de aportul de LS necesită activarea Kir4.1 basolateral în DCT, în timp ce inhibarea NCC indusă de aportul HS necesită suprimarea activității Kir4.1.

Metode

Animale

Toate studiile pe animale au fost aprobate de Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din New York Medical College. Șoarecii care exprimă transaxen Pax8-rtTA și tet-on LC-1 au fost încrucișați cu șoareci Kcnj10 flox/flox pentru a genera șoareci inductibili renali Kir4.1 knockout (Ks-Kir4.1 KO) (informații detaliate sunt furnizate în Material suplimentar). Ștergerea Kcnj10 a fost efectuată la șoareci masculi și/sau femele în vârstă de 8 până la 10 săptămâni homozigoți pentru gena Kcnj10 floxată și hemizigot pentru transgena Pax8-rtTA/LC-1 prin furnizarea de doxiciclină (5 mg/ml, 5% zaharoză) în apa potabilă timp de 2 săptămâni. Acest lucru a fost urmat de cel puțin două săptămâni suplimentare fără tratament cu doxiciclină înainte de efectuarea experimentelor, iar șoarecii au fost ținuți într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au fost hrăniți cu o dietă normală de rozătoare și apă potabilă simplă. Șoareci Littermate (masculin și feminin Kcnj10 flox/flox) de aceeași vârstă și fond genetic care consumă 5% zaharoză au fost folosiți ca martori de tip sălbatic (WT). După 2 săptămâni pe o dietă normală de sodiu (NS; 0,4%), șoarecii au fost apoi hrăniți cu dietă LS (TD90228, 0,01% -0,02%) sau HS (TD92034, 4,0%) timp de încă 7 zile înainte de experimente. Metoda de genotipare a șoarecilor și prepararea DCT a fost descrisă anterior și este inclusă în materialul suplimentar. 15

Experiment Patch-Clamp

Clearance renal și analiză urinară/plasmatică Na +/K +

Metoda detaliată pentru clearance-ul renal este descrisă în Materialul suplimentar. După operație, șoarecii au fost perfuzați cu soluție salină izotonică intravenos timp de 4 ore (0,25-0,3 ml/h și total 1,0-1,2 ml) pentru a menține hemodinamica. Colecțiile de urină au început la 1 oră după perfuzie de 0,3 ml soluție salină și s-au efectuat un total de șase colecții (la fiecare 30 de minute) (două pentru controale și patru pentru experimente).

Analize materiale și statistice

HCTZ și doxiciclina au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), iar dietele LS sau HS au fost obținute de la Laboratoarele Harlan (Madison, WI). Toate dietele conțineau aceeași cantitate de K + și componente nutriționale. Datele au fost analizate folosind testul t pentru comparații între două grupuri sau ANOVA unidirecțional/bidirecțional urmat de testul Holm-Sidak pentru comparații între mai mult de două grupuri. Valori P + admisie reglează Kir4.1/Kir5.1

Na + scăzut stimulează în timp ce Na + ridicat inhibă curenții K + ai celulelor DCT. (A) Un set de înregistrări care prezintă curenți K + sensibili Ba 2+ măsurați cu protocolul de pas de la -60 la 60 mV sau (B) măsurat cu protocolul de rampă de la -100 la 100 mV în DCT-ul șoarecilor WT pe Na scăzută +, Na + normal și dietele ridicate de Na + timp de 7 zile, respectiv. Panoul de jos este graficul cu bare care rezumă valorile măsurate la -60 mV cu înregistrare cu celule întregi la șoareci WT. Pentru înregistrarea cu celule întregi, s-a folosit o soluție simetrică K + 140 mM pentru baie și pipetă. (C) Curenți K + sensibili Ba 2+ măsurați cu protocolul de pas de la -100 la 60 mV sau (D) măsurat cu protocolul de rampă de la -100 la 100 mV în DCT-ul șoarecilor Ks-Kir4.1 KO pe Na scăzut + (roșu), Na + normal (negru) și dietele cu conținut ridicat de Na + (verde) timp de 7 zile, respectiv. Panoul de jos este graficul cu bare care rezumă valorile măsurate la -60 mV cu înregistrare cu celule întregi la șoareci X-Kir4.1 KO. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru a determina semnificația.

Aportul Na + dietetic afectează potențialul membranei DCT și conductivitatea Cl

Na + scăzut hiperpolarizează în timp ce Na + ridicat depolarizează membranele DCT. O înregistrare care arată potențialul de inversare IK în celulele DCT ale șoarecilor (A) WT și (B) Ks-Kir4,1 KO pe o dietă normală de Na + (negru), scăzută cu Na + (roșie) sau cu un nivel ridicat de Na + (verde) timp de 7 zile. (C) Un grafic cu bare care rezumă potențialul de inversare IK la șoareci WT și Ks-Kir4.1 KO pe diferite diete Na +. Pentru măsurarea potențialului de inversare IK, soluția de baie conținea 140 mM NaCI și 5 mM KCl, iar soluția de pipetă conținea 140 mM KCl. (D) Un grafic cu bare care rezumă rezultatele experimentelor în care curenții Cl - sensibili la NPPB din DCT au fost măsurați la -60 mV cu înregistrarea întregii celule în WT sau în șoareci Ks-Kir4.1 KO pe un Na normal + (negru), scăzut de Na + (roșu) sau dietă ridicată de Na + (verde) timp de 7 zile. Pentru măsurarea curentului de Cl - sensibil la NPPB, soluția de baie conținea 140 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2 și 10 mM HEPES (pH 7,4). Semnificația a fost determinată de ANOVA unidirecțional (pentru mai mult de două grupuri) sau de testul t (pentru două grupuri).

Efectul admisiei LS sau HS asupra NCC este compromis la șoarecii Ks-Kir4.1 KO

Ștergerea Kir4.1 elimină efectul aportului de Na + dietetic asupra NCC. (A) Imunoblot care arată expresia pNCC (la Thr 53) și tNCC în WT (șase benzi stânga) și în șoareci Ks-Kir4.1 KO (șase benzi dreapta) pe diferite diete Na + timp de 7 zile. Un grafic cu bare rezumă intensitatea benzii normalizate a experimentelor de mai sus pentru (B) pNCC și (C) tNCC, respectiv (șapte șoareci). Western blots au fost generate din lizatele tisulare recoltate din cortexul renal. ANOVA cu două căi a fost utilizat pentru determinarea semnificației.

Ștergerea Kir4.1 crește ENaC. (A) O Western blot care arată expresia subunităților ENaC-α, -β și γ la șoareci WT și Ks-Kir4.1 KO pe o dietă scăzută de Na +, Na + normală și Na + ridicată timp de 7 zile, respectiv (n = 6 șoareci). (B) O înregistrare cu celule întregi care prezintă curenți de Na + sensibili la amiloride în DCT2 a șoarecilor WT și Ks-Kir4.1 KO pe o dietă normală de Na +. Un grafic de diagramă de dispersie arată valoarea medie și fiecare punct de date măsurat la -60 mV la șoareci WT (n = 5 tubuli) și Ks-Kir4.1 KO (n = 6 tubuli). Semnificația a fost determinată de testul t.

Aportul dietetic de Na + nu a afectat excreția urinară de K +

Ștergerea Kir4.1 crește excreția urinară de K +. (A) Grafic liniar care arată rezultatele fiecărui experiment în care efectul HCTZ-ului cu doză unică asupra excreției urinare de K + (EK) în 120 de minute a fost examinat cu metoda clearance-ului renal la șoarecii WT sau Ks-Kir4.1 KO pe dietele normale de Na +, Na + ridicat și respectiv Na + redus. Testul t a fost utilizat pentru a determina semnificația. (B) Un grafic cu bare care prezintă valoarea medie și informații statistice pentru toate experimentele de mai sus (opt șoareci pentru fiecare grup). ANOVA bidirecțional a fost utilizat pentru determinarea semnificației. * Aportul de P + nu afectează concentrațiile plasmatice de K +. Un grafic de dispersie care prezintă concentrațiile plasmatice (A) K + sau concentrațiile (B) Na + la șoareci WT și Ks-Kir4,1 KO pe o dietă scăzută de Na +, Na + normală și Na + ridicată timp de 7 zile, respectiv = 6 –8 șoareci). Valoarea medie și SEM ale măsurătorilor de mai sus sunt prezentate în tabelul (C). * indică o diferență semnificativă în comparație cu controlul WT (determinat de ANOVA cu două căi).

Aportul alimentar de K + nu afectează concentrațiile plasmatice de K +. Un grafic dispersat care arată concentrațiile plasmatice (A) K + sau concentrațiile (B) Na + la șoarecii WT și Ks-Kir4,1 KO pe o dietă scăzută de Na +, Na + normală și Na + ridicată timp de 7 zile, respectiv = 6 –8 șoareci). Valoarea medie și SEM ale măsurătorilor de mai sus sunt prezentate în tabelul (C). * indică o diferență semnificativă în comparație cu controlul WT (determinat de ANOVA cu două căi).

Ștergerea Kir4.1 a crescut excreția urinară de K + la șoarecii Ks-Kir4.1 KO pe o dietă NS comparativ cu cei ai șoarecilor WT corespunzători (1,01 ± 0,04 μEq/min per 100 g corp greutate). Mai mult, aplicația HCTZ nu a avut niciun efect suplimentar asupra excreției urinare K + la șoarecii Ks-Kir4.1 KO pe o dietă NS (1,12 ± 0,06 μEq/min per 100 g corp greutate). De asemenea, nici aportul de LS, nici de HS nu au afectat semnificativ nivelul bazal al excreției urinare de K + la șoarecii Ks-Kir4,1 KO comparativ cu cei pe o dietă NS (LS, 1,08 ± 0,08 μEq/min per 100 g corp greutate; HS, 0,95 ± 0,05 μEq/min per 100 g corp greutate). Mai mult, aplicarea HCTZ nu a avut niciun efect suplimentar asupra excreției K + urinare la șoarecii Ks-Kir4.1 KO pe o dietă LS (1,20 ± 0,05 μEq/min per 100 g corp greutate) sau HS (1,01 ± 0,04 μEq/min per 100 g corp greutate). Noțiunea că aportul dietetic de Na + nu a avut niciun efect semnificativ asupra excreției urinare de K + la șoarecii Ks-Kir4.1 KO a fost sugerată și prin măsurarea concentrațiilor plasmatice de K + și Na + (Figura 8, A și B). Deși șoarecii Ks-Kir4.1 au fost hipokalemici (2,48 ± 0,14 mM), nici aportul de HS și nici de LS nu au mai modificat concentrațiile plasmatice de K + (LS, 2,52 ± 0,11 mM; HS, 2,49 ± 0,14 mM). Astfel, aportul dietetic de Na + nu a avut niciun efect net asupra excreției urinare de K + sau asupra concentrațiilor plasmatice de Na +/K + la șoarecii WT și Ks-Kir4,1 KO.

Discuţie

Principala constatare a acestui studiu este că activitatea bazolaterală Kir4.1 este necesară pentru efectul aportului de Na + din dietă asupra activității NCC. Kir5.1 este exprimat și în TAL și CCD, 25.26 ștergerea Kir4.1 în rinichi este de așteptat să afecteze conductanța bazolaterală K + în TAL și în CCD. Astfel, este posibil ca Kir4.1 din TAL și CCD să fie, de asemenea, implicat în medierea efectului aportului de Na + asupra NCC. Cu toate acestea, constatarea că ștergerea Kir4.1 a provocat o depolarizare mai mare a membranei în DCT decât în ​​TAL și CCD indică cu tărie că Kir4.1 joacă un rol dominant în determinarea potențialului membranei în DCT în comparație cu TAL și CCD. 25.26 Acest lucru se datorează parțial faptului că s-au demonstrat că canalele K +, altele decât Kir4.1, sunt exprimate în TAL și CCD, dar nu și în DCT. Astfel, Kir4.1 în DCT ar trebui să joace un rol dominant în medierea efectului dietelor de Na + asupra NCC.

Studiul nostru a arătat, de asemenea, că aportul dietetic de Na + nu a modificat semnificativ rata de excreție renală K + și concentrațiile plasmatice de K +. Această constatare este în concordanță cu un raport anterior al lui Young și colab., 24 care arată că creșterea aportului de Na + la câini nu a modificat nici excreția urinară de K +, nici nivelul plasmatic de K +. S-a sugerat că mecanismul de reacție dependent de aldosteron a fost responsabil pentru menținerea constantă a excreției renale de K + ca răspuns la modificarea aportului de Na + din dietă, deoarece aportul de LS a scăzut, în timp ce aportul de HS a crescut excreția de K + renal la câinii adrenalectomizați. De asemenea, deși șoarecii Ks-Kir4.1 KO au fost hipokalemici, aportul dietetic de Na + nu a modificat în continuare nivelurile plasmatice de K + și rata de excreție urinară de K +. După cum sa discutat mai sus, acest lucru sugerează cu tărie că absorbția de Na + electroneutral dependentă de pendrină/NDCBE a fost responsabilă pentru compensarea funcției NCC la șoarecii Ks-Kir4.1 KO, prevenind astfel risipa de K +.

Dezvăluiri

Material suplimentar

Figura suplimentară 1. Modelul celular al DCT1 și DCT2.