Abstract

A sublinia Plantele transgenice cu supraexpresie OsSPL14 au prezentat o perioadă de creștere mai scurtă, frunze de steag scurte și înguste și frunze verzi groase. Profilul transcript, nivelul acidului abscisic (ABA) și al acidului giberelinic (GA3), precum și compoziția culmului s-au schimbat, de asemenea, în mod evident.

mh86

Introducere

OsSPL14 este membru al genelor SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL). Genele SPL codifică factori de transcripție specifici plantelor care conțin un domeniu de legare a ADN-ului care conține ion de zinc foarte conținut, cunoscut sub numele de SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN [SBP] -box (Yamasaki și colab., 2004). SPB1 și SPB2 au fost genele SPL originale identificate în Antirrhinum majusas care se leagă de promotorul genei de identitate a meristemului floral SQUAMOSA (Klein și colab., 1996).

Multe gene SPL conțin un situs țintă de miARN (microARN), inclusiv miR156/157, iar situsurile țintă sunt situate în regiunile de codificare sau regiunea 3 'netradusă (3' UTR). În Arabidopsis thaliana, 10 din 16 gene SPL s-au prezis a fi ținte ale miR156 (Rhoades și colab., 2002; Schwab R și colab., 2005). SPL3, SPL4 și SPL5 au un site țintă pentru miR156 în UTR de 3 ′ și sunt puternic reprimate de miR156. Supraexprimarea SPL3 a accelerat înflorirea și plantele care exprimă SPL3 conținând situl țintă miR156 mutat sau fără situl țintă miR156 au apărut înflorire anterioară și mai puține frunze (Cardon și colab., 1997; Wu și Poethig, 2006; Gandikota și colab., 2007). În plus, genele paralogice SPL9 și SPL15 cu situl țintă miR156 implicate în controlul tranziției fazei juvenil-adulte și mutanții dubli spl9 spl15 au prezentat plastocron scurtat, arhitectura inflorescenței modificate și ramificarea îmbunătățită (Schwarz și colab., 2008; Wang și colab., 2008). În plus, SPL8 fără site-uri țintă miARN a afectat megasporogeneza, formarea trichomului pe sepale și alungirea filamentului de stamină (Unte și colab., 2003). În consecință, o serie de studii privind gena SPL în Arabidopsis thaliana au sugerat că genele AtSPL asociate în principal cu dezvoltarea și înflorirea plantelor.

În acest studiu, am introdus OsSPL14 în cultivarul indica „MH86” și am obținut linii transgenice care supraexprimă OsSPL14 cu o perioadă de creștere mai scurtă, frunze de steag scurte și înguste, cu un număr mai redus de timon, cu vânt puternic. Analiza transcriptomului a indicat faptul că genele implicate în biosinteza carotenoidelor și în biosinteza ligninei au fost reglate în sus în planta transgenică. Nivelurile de ABA și GA3 s-au îmbunătățit, iar conținutul de lignină, celuloză, siliciu și potasiu a crescut evident. Luate împreună, aceste descoperiri completează descrierea funcției OsSPL14.

Materiale și metode

Generarea orezului transgenic

Plasmida pCAMBIA1300-OsSPL14 (Fig. Suplimentară S1; OsSPL14/IPA1: GenBank GU136674.1, 7229 bp care conține promotorul și regiunea de codificare pentru ARNm) a fost introdusă în embrioni de orez matur (cultivar Oryza sativa L.indica „MH86”) folosind Agrobacterium -transformare mediată așa cum este descris de Datta (1997). Celulele transformate au fost selectate inițial pe mediu NB (Sivamani și colab., 1996) conținând 50 mg/L higromicină (SIGMA-ALORICH). După 3-4 cicluri de selecție cu o durată de 14 zile pe ciclu, grupurile de celule supraviețuitoare au fost regenerate. Plantele care au fost generate au fost selectate în continuare în soluția de cultură conținând 20 mg/L higromicină cu o perioadă de 16 ore la 26 ° C timp de 4 săptămâni și apoi transferate într-o seră și crescute cu plante WT sub lumina soarelui naturală.

ADN-ul genomic a fost preparat din plantele rezistente la bialafos prin metoda bromurii de cetiltrimetilamoniu (CTAB) și utilizat ca model pentru reacția în lanț a polimerazei (PCR) și analiza Southern blot. Prezența genei introduse în plantele regenerate a fost verificată prin PCR folosind grundurile Hygromycin F/R. Un total de 100 μg ADN per probă a fost digerat peste noapte cu enzimă de restricție EcoRI la 37 ° C. ADN-ul digerat a fost fracționat în geluri TAE-agaroză 1% (g/v) și apoi transferat la o membrană de nailon Hybond-N (Amersham, Arlington Heights, IL, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. O secvență parțială de genă Hygromycin a fost izolată din plasmidă și marcată folosind un kit de etichetare directă AlkPhos (Amersham) pentru a realiza sondele de hibridizare. Apoi fragmentele de ADN de pe membrana de nailon Hybond-N au fost hibridizate cu sonda Hygromycin.

ARN-ul total a fost izolat din plante PCR pozitive și WT folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, SUA). ADNc de prima catenă a fost sintetizat din 2 μg de ARN total utilizând kitul de sinteză ADN-ul de catenă RevertAid ™ (Fermentas, LTU) urmând instrucțiunile producătorului. Reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR) a fost efectuată folosind grunduri Hygromycin F/R și Actin150 F/R.

Plantele transgenice au fost cultivate într-un câmp experimental transgenic. Și plante transgenice moștenite stabil care posedă două copii ale transgenului au fost selectate și utilizate în acest studiu.

Secvențierea ARN și analiza transcriptomului

Pe baza informațiilor de localizare a citirilor mapate, nivelurile de expresie genică au fost calculate de către componentele cuffquant și cuffnorm ale software-ului cufflinks folosind fragmente pe kilobază de transcriere la milion de fragmente mapate (FPKM) ca indice de măsurare. Conform standardului de screening pentru modificarea pliurilor (FC) ≥2 și rata de descoperire falsă (FDR) Analiza fenotipului plantei. (A) Arhitectura vegetală a plantei sălbatice MH86 și OE: plantă transgenică OsSPL14. (B) Caracter morfologic al frunzei. (C) Lungimea frunzei pavilionului. (D) Lățimea frunzei pavilionului. (E) Numărul lucrătorilor. (F) Diametrul internodului antepenultim. (G) Grosimea peretelui internodului antepenultimat. (H) Înălțimea plantei. (I) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi al frunzei în stadiul de însămânțare. (J) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi din frunza steagului în stadiul de maturitate. Bara = 5 cm. (* P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001).

(A) Arhitectura vegetală a plantei sălbatice MH86 și OE: plantă transgenică OsSPL14. (B) Caracter morfologic al frunzei. (C) Lungimea frunzei pavilionului. (D) Lățimea frunzei pavilionului. (E) Numărul lucrătorilor. (F) Diametrul internodului antepenultim. (G) Grosimea peretelui internodului antepenultimat. (H) Înălțimea plantei. (I) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi al frunzei în stadiul de însămânțare. (J) Clorofila a, clorofila b și conținutul de carotenoizi al frunzei de steag în stadiul de maturitate. Bara = 5 cm. (* P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001).

Analiza comparativă a profilării transcriptomului

(A) Complot vulcanic de DEG-uri. Valoarea absolută mai mare a absciselor înseamnă multiplu diferit mai mare, iar valoarea ordonată mai mare înseamnă expresie diferențială mai semnificativă. Fiecare punct reprezintă o genă, în detaliu, punctele verzi reprezintă gene reglate în jos, punctele roșii reprezintă gene reglate în sus, iar punctele albastre reprezintă gene nediferențiate. (B) Clasificări ontologice genice ale DEG-urilor. Abscisa este clasificarea GO, partea stângă a ordonatei este procentul de gene, iar partea dreaptă este numărul de gene. (C) Termenii GO cei mai îmbogățiți. Ordonatul este termen GO îmbogățit, iar abscisa este valoarea q. Cifrele de pe coloană reprezintă numărul de gene exprimate diferențial. Diferite culori reprezintă procese biologice, componente celulare și funcții moleculare, respectiv. (D) Schema de împrăștiere a îmbogățirii KEGG. Axa longitudinală reprezintă numele căii, iar axa laterală reprezintă factorul bogat. Dimensiunea punctului indică numărul de gene exprimate diferențial în cale, iar culoarea punctului corespunde unui interval diferit de valoare Q.

Ulterior, ontologia genică (GO) a fost utilizată pentru a clasifica funcțiile DEG-urilor. DEG-urile au fost clasificate în trei mari categorii GO, inclusiv proces biologic, componentă celulară și funcție moleculară, care conțineau în total 51 de grupuri de funcții (Fig. 2B). Între timp, cei mai îmbogățiți termeni GO au fost conduși de KOBAS (2.0) cu FDR≤0.05 și a arătat că DEG-urile au fost grupate în 20 de termeni GO diferiți, inclusiv 15 termeni pentru funcția moleculară, 3 termeni pentru procesul biologic și 2 termeni pentru componenta celulară (Fig. 2C). Aceasta a sugerat că DEG-urile adnotate cu termeni GO erau legate în principal de „legarea ionilor”, „legarea hemului”, „legarea ADN-ului specific secvenței”, „procesul de reducere a oxidării”, „reglarea transcripției” și „legarea membranei citoplasmatice”.

Analiza expresiei genei prin qRT-PCR

În primul rând, am analizat expresia OsSPL14 în liniile transgenice OE: OsSPL14. Așa cum era de așteptat, expresia OsSPL14 a crescut evident în liniile transgenice detectate (Fig. 3A). Pentru a confirma DEG-urile identificate în analiza transcriptomului, mai multe gene din cele cinci căi KEGG selectate în ultima parte au fost analizate prin qRT-PCR. Și rezultatul a sugerat că expresia a 15 DEG-uri reglementate în sus a fost mai mare în plantele transgenice OE: OsSPL14 decât cea din „MH86” (Fig. 3B). Între timp, expresia a cinci DEG-uri reglementate în jos a fost mai mică în plantele transgenice OE: OsSPL14 decât cea din „MH86” (Fig. 3C). Pe scurt, profilurile de expresie ale DEG-urilor analizate prin qRT-PCR au fost în concordanță cu analiza transcriptomului.

(A) Analiza expresiei OsSPL14 în WT și OE: liniile transgenice OsSPL14. (B) Modelele de expresie a 15 gene reglate în sus au fost validate prin qRT-PCR. C4H (502): BGIOSGA006502; C4H (177): BGIOSGA008177. (C) Modelele de expresie ale genelor 5-reglementate au fost validate prin qRT-PCR. (D) Profilurile de expresie ale TB1, DEP1, D17, D53, D14 și D3.

Conform cercetărilor anterioare, OsSPL14 a reglementat expresia TB1 și DEP1, iar OsSPL14 poate acționa cu D53 pentru a media dezvoltarea dezvoltării regulate a strigolactonei (SL) (Lu și colab., 2013; Song și colab., 2017). Astfel, profilurile de expresie ale TB1, DEP1 și ale unor gene legate de biosinteza SL sau transducția semnalului SL au fost, de asemenea, analizate prin qRT-PCR. Rezultatul a indicat faptul că TB1 nu a avut nicio modificare evidentă, în timp ce DEP1 a fost ușor reglat în plantele transgenice OE: OsSPL14. În plus, comparativ cu „MH86”, DWARF 17 (D17) implicat în biosinteza SL a fost supus reglării în plantele transgenice OE: OsSPL14. DWARF 14 (D14) și DWARF 3 (D3) implicate în transducția semnalului SL au fost reglate în sus în plantele transgenice (Fig. 3D). Aceste rezultate au sugerat că supraexprimarea OsSPL14 ar putea într-adevăr să influențeze expresia mai multor gene implicate în arhitectura plantelor.

Modificări ale conținutului ABA, JA și GA3

(A) Conținutul de ABA în stadiul de însămânțare și stadiul de cultivare. (B) Conținutul de JA în stadiul de însămânțare și stadiul de cultivare. (C) Conținutul GA3 în stadiul de însămânțare și stadiul de prelucrare. (* P≤0,05, ** P ≤0,01, *** P≤0,001).

Scanarea și analiza compoziției culmului

O caracteristică evidentă a OE: plantele transgenice OsSPL14 este culmea lor puternică. În consecință, structura organizatorică internă a culmului a fost observată prin microscopie electronică cu scanare (SEM). Observația a arătat că plantele transgenice OE: OsSPL14 aveau mai multe pachete vasculare mici și celule sclerenchimale și, de asemenea, aveau pachete vasculare mari mai mari. Mai mult, era evident că gradul lignificat al celulei corticale a fost mai mare în OE: planta transgenică OsSPL14 (Fig. 5A).

(A) Analiza microscopiei cu scanare electronică. BVB: fascicul vascular mare; SVB: fascicule vasculare mici; SC: celulă sclerenchimatică. (B) Conținutul de lignină al culmei. (C) Conținutul de celuloză al culmei. (D) Conținutul de siliciu al culmei. (E) Conținutul de potasiu al culmii.

Pe baza analizei transcriptomului din acest articol și a modificărilor structurii organizatorice interne a culmului, este de remarcat faptul că profilurile de expresie ale genelor cheie implicate în biosinteza ligninei și în metabolismul glucidelor s-au schimbat semnificativ. Ulterior, am emis ipoteza că compoziția culm a plantei transgenice OE: OsSPL14 se va schimba probabil. Pentru a testa această predicție, am măsurat conținutul de lignină, celuloză, siliciu și potasiu al culmei. Spre deosebire de cel al „MH86”, conținutul de lignină al plantei transgenice OE: OsSPL14 a crescut distinct, cu 17% și respectiv 30% în cele două linii (Fig. 5B). Și conținutul de celuloză al liniilor transgenice a crescut, de asemenea, cu 13% și 16% (Fig. 5C). În mod remarcabil, conținutul de siliciu al plantei transgenice a crescut dramatic cu 45% și 78% comparativ cu cel al „MH86” (Fig. 5D). În plus, conținutul de potasiu a crescut, de asemenea, în mod evident, cu 18% și, respectiv, 19% (Fig. 5E). Evident, supraexprimarea OsSPL14 în orez ar provoca mari schimbări în caracterul și compoziția culmilor. În plus, este bine cunoscut faptul că compoziția culmului este strâns legată de rezistența mecanică a culmului, ceea ce ar putea explica probabil constatările anterioare că rezistența mecanică a culmelor a plantei NIL OsSPL14 ipa1 cu expresie ridicată a OsSPL14 a fost semnificativ crescută (Jiao și colab., 2010 ).

Analiza calității cerealelor

Este clar că liniile transgenice care supraexprimă OsSPL14 au paniculă mare, mai multe ramificații și mai multe boabe per paniculă (Jiao și colab., 2010; Miura și colab., 2010). Aici, am efectuat analize de calitate a boabelor de plante transgenice OE: OsSPL14. Rezultatul a indicat faptul că rata orezului brun, rata orezului măcinat și consistența gelului nu au avut nicio modificare evidentă în planta transgenică (Fig. 6A, B, C). În timp ce viteza orezului de cap și lungimea boabelor de plante transgenice OE: OsSPL14 au scăzut ușor (Fig6. D, E), iar temperatura de gelatinizare a crescut ușor (Fig6. F). Conținutul de amiloză al plantei transgenice a scăzut evident (Fig6. G). Cu toate acestea, raportul de cretă al plantei transgenice OE: OsSPL14 a fost de două ori mai mare decât cel al „MH86” (Fig. 6H). Între timp, gradul de cretă a fost de 2,2 ori mai mare decât cel al „MH86” (Fig. 6 I). Raportul mai mare de calcarie și gradul de calcarie au indus transparența scăzută (Fig6. J). Prin urmare, se părea că unele caractere de calitate a boabelor de plante transgenice OE: OsSPL14 s-au schimbat într-o anumită măsură.

(A) Rata orezului brun. (B) Rata de orez măcinată. (C) Consistența gelului. (D) Rata orezului. (E) Lungimea bobului. (F) Temperatura de gelatinizare. (G) Conținutul de amiloză. (H) Raportul de cretitate. (I) Gradul de cretitate. (J) Transparență. (* P≤0,05, ** P≤0,01)

Discuţie

Un model pentru funcția OsSPL14 în reglarea creșterii și dezvoltării plantelor. Săgețile cu linie punctată înseamnă că există mecanisme moleculare neclare. RISC: Complex de tăcere indus de ARN; L: Lignină; C: celuloză; Si: siliciu; K: Potasiu.