Abstract

  • AK, adenilat kinază
  • AMPK, proteina kinază activată de AMP
  • CK, creatin kinază
  • GAPDH, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază
  • HOMA, evaluarea modelului homeostaziei
  • MALDI, desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice
  • MS, spectrometrie de masă
  • pI, punct izoelectric
  • TOF, timpul zborului

O pierdere a glucozei sistemice și a homeostaziei lipidice, care implică mai multe sisteme de organe, elimină bolile legate de obezitate, cum ar fi sindromul metabolic și diabetul de tip 2. Mai exact, se presupune că apar defecte în procesele metabolice cheie care dirijează intrarea, depozitarea și catabolismul oxidativ al glucozei și acizilor grași (1-4). Acum este larg acceptat faptul că mușchii scheletici joacă un rol considerabil în reglarea nivelurilor de glucoză și lipide circulante și că această capacitate este semnificativ deprimată la indivizii obezi și/sau inactivi (2,3,5). De fapt, studii recente asupra mușchilor scheletici umani au relevat o scădere a procentului de fibre musculare de tip I (oxidativ) și scăderi paralele în transportul glucozei musculare și oxidarea lipidelor la persoanele obeze cu și fără diabet de tip 2 față de subiecții de control slab, 3,5,6). Aceste observații indică o disfuncție metabolică semnificativă la nivelul mușchilor de la indivizii obezi care contribuie la dezvoltarea intoleranței la glucoză, dislipidemie și eventuala apariție a diabetului de tip 2.

mușchilor

Noile tehnici pentru constatarea imparțială a evenimentelor moleculare complexe în mușchiul scheletic bolnav, deteriorat și adaptat la efort includ utilizarea microarrays-urilor oligonucleotidice și analiza proteomică utilizând spectroscopia de masă (7-10). Deși au existat o serie de studii de microarrays ale mușchilor diabetici și obezi pe o varietate de modele experimentale animale și umane, singurul consens real este aparenta reglare descendentă a genelor care codifică enzimele metabolismului oxidativ cu obezitate și diabet (11). Deși nivelurile de transcripție ale ARNm răspund acut la întreruperile metabolice și mecanice din mușchi, acestea nu se traduc întotdeauna imediat în modificări ale abundenței produselor proteice corespunzătoare (7,9). În consecință, există un sprijin din ce în ce mai mare pentru utilizarea tehnicilor de profilare a proteinelor pentru a ajuta la producerea unei etiologii moleculare mai cuprinzătoare a remodelării musculare și a stărilor de boală.

Standardizarea electroforezei bidimensionale și identificarea din ce în ce mai rapidă a proteinelor utilizând spectroscopia de masă a făcut evaluarea de mare viteză a modificărilor expresiei proteinelor atât practice, cât și rentabile (9,12). În studiul de față, am analizat proteinele citosolice ale mușchilor scheletici de la femeile slabe, obeze/supraponderale și cu obezitate morbidă pentru a identifica enzimele care pot explica defectele metabolismului muscular. Acest studiu preliminar al extractelor citosolice solubile a identificat adenilat kinaza (AK) 1, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și aldolaza A ca fiind exprimate preferențial în extracte de mușchi de la indivizi obezi și obezi morbid față de subiecții martori slabi. Considerăm că această descoperire oferă perspective mecaniciste asupra defectelor metabolismului muscular care stau la baza progresului bolilor metabolice legate de obezitate.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Optsprezece femei au participat la această investigație, constând din 6 greutate normală (vârsta 45,1 ± 3,1 ani; IMC 23,8 ± 0,58 kg/m2; evaluarea modelului de homeostazie [HOMA] 1,10 ± 0,26), 6 supraponderale/obeze (vârsta 44,0 ± 2,8 ani; IMC 30,2 ± 0,81 kg/m 2; HOMA 1,6 ± 0,47) și 6 extrem de obezi (vârsta 37,9 ± 3,3 ani; IMC 53,8 ± 3,5 kg/m 2; HOMA 3,6 ± 1,1) pacienți supuși unei intervenții chirurgicale abdominale, în principal bypass gastric și histerectomia abdominală totală (3). Participanții la cercetare au fost clasificați în grupurile lor respective pe baza IMC și a clasificărilor supraponderale și obezității stabilite de Institutele Naționale de Sănătate (13). Criteriile IMC pentru subiecții cu greutate normală, supraponderală/obeză și extrem de obeză au fost 24,9, 25,0-34,9 și, respectiv, ≥40 kg/m 2. HOMA pentru rezistența la insulină și funcția celulelor β a fost calculat din concentrațiile plasmatice de glucoză și insulină în jeun (14). Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul de politici și revizuiri al Universității din Carolina de Est pentru cercetarea umană și a fost în conformitate cu principiile exprimate în Declarația de la Helsinki. Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții. Niciunul dintre subiecți nu a avut boli sau a luat medicamente despre care se știe că modifică metabolismul carbohidraților sau lipidelor.

Extracția digitoninei a proteinelor citosolice.

O probă de țesut rectus abdominus a fost obținută în timpul intervenției chirurgicale și tratată așa cum s-a descris anterior (3). Proteinele citosolice au fost extrase din 25-30 mg de țesut pulverizat cu azot folosind 500 μl de tampon de extracție digitonină (10 mmol/l Tevi, 0,015% digitonină, 300 mmol/l zaharoză, 100 mmol/l NaCl, 3 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l EDTA și 1 mmol/l inhibitor de protează [fluorură de fenilmetilsulfonil], pH 6,8) cu inversare ușoară la 4 ° C timp de 20 min (12). Fracția citosolică a fost separată de restul peletei celulare prin centrifugare la 500 g timp de 10 min. Peletele celulare au fost congelate rapid și depozitate la -80 ° C pentru analize viitoare. Supernatantul care conține proteină citosolică a fost transferat într-un tub curat și centrifugat la 8.000 g timp de 20 de minute. Concentrația de proteine ​​a fost determinată în supernatantul final utilizând reactivul colorant pentru testul proteinei Bio-Rad, urmând instrucțiunile producătorului (Bio-Rad, Hercules, CA). Proba a fost apoi depozitată în alicote de 500 μl în tuburi de microcentrifugă la -80 ° C.

Electroforeză bidimensională pe gel.

Cuantificare și analiză bidimensională a gelului.

Gelurile bidimensionale au fost analizate folosind pachetul software Z3 (Compugen, Tel Aviv, Israel) folosind setările recomandate de producător. Punctul izoelectric (pI) și masa moleculară au fost calculate pe baza poziției fiecărei proteine ​​în banda IPG și gelul de a doua dimensiune. Proteinele exprimate diferențial, valorile de intensitate medie și abaterile standard au fost calculate pentru fiecare punct și normalizate la punctele corespunzătoare de pe gelurile master slabe.

Pregătirea și identificarea spectrometriei de masă a proteinelor.

Petele au fost excizate cu tipul de pipetă din polipropilenă curată și transferate într-un tub de microcentrifugă care conține 100 pl de apă deionizată. Digestia triptică a fost preformată așa cum s-a descris anterior (9), iar peptidele au fost extrase și apoi uscate prin centrifugare sub vid. Peptidele uscate s-au dizolvat ulterior în 10 μl de acid trifluoroacetic 0,1% și s-au desalinizat folosind vârfuri de micropipetă C18 ZipTip (Millipore, Bedford, MA) urmând instrucțiunile producătorului. Alicote de soluții peptidice au fost reperate pe placa de desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice (MALDI). Analizele de spectrometrie de masă (MS) și spectrometrie de masă tandem (MS/MS) au fost efectuate pe un spectrometru de masă de timp de zbor ABI (TOF) -TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA) echipat cu un Nd: YAG 200 Hz laser. Instrumentul a fost operat cu extracție întârziată în modul ion reflector pozitiv. Un amestec de peptide standard a fost utilizat pentru calibrarea externă a instrumentului. Identificarea proteinelor a fost efectuată utilizând software-ul GPS Explorer (Applied Biosystems) și baza de date MASCOT. Ambele date MS și MS/MS au fost utilizate pentru identificarea proteinelor.

Analize enzimatice.

Testele standard pentru AK1 și creatin kinază (CK) au fost efectuate folosind protocoale stabilite care au fost descrise anterior (9,15,16). Pe scurt, probele de mușchi congelate au fost pulverizate în azot lichid și apoi extrase într-un tampon de omogenizare conținând 150 mmol/l NaCI, 60 mmol/l Tris-HCI, pH 7,5, 5 mmol/l EDTA, 0,2% Triton X-100 și un cocktail inhibitor de protează. Activitățile totale au fost măsurate utilizând un test enzimatic cuplat într-un cititor de microplăci Labsystems Multiskan MCC/340 cu 96 de godeuri (Fisher Scientific) la 340 nm. Numărul de subiecți utilizați pentru a determina activitatea enzimatică a fost mai mic decât cei utilizați pentru a evalua modelele bidimensionale de proteine ​​de gel, deoarece cantitatea de țesut disponibilă a fost limitată. În plus, deoarece mușchii au fost obținuți de la unii indivizi supuși histerectomiei (din diverse motive) și alții supuși unui bypass gastric, considerăm că aceasta ar putea fi o variabilă potențială confuză în interpretarea noastră a datelor.

analize statistice.

Rezultatele cuantificării proteinelor și testelor enzimatice au fost exprimate ca medii ± SE. Testul t al studentului a fost utilizat pentru toate analizele statistice, iar P ≤ 0,05 a fost luat în considerare pentru semnificația biologică. Testele pentru semnificația statistică au fost corectate pentru multitestare

REZULTATE

Analiza proteomică a mușchiului scheletic obez.

Proteinele citosolice au fost extrase din mușchiul rectus abdominus al femeilor slabe, obeze/supraponderale și cu obezitate morbidă și au fost analizate pentru diferențe semnificative cu progresia obezității. Profilele proteice au fost analizate folosind electroforeza bidimensională pe gel cuplată cu spectroscopia de masă pentru a identifica proteinele exprimate diferențial. A fost utilizată o metodă de extracție secvențială, deoarece s-a crezut că conținutul proporțional ridicat de proteine ​​contractile din mușchiul scheletic ar introduce variabilitate semnificativă, ceea ce face dificilă constatarea calitativă și cantitativă a expresiei diferențiale. Gama largă pI de 3-10 a fost aleasă pentru a include cât mai multe proteine ​​posibil. Figura 1A prezintă profiluri reprezentative de proteine ​​bidimensionale ale proteinelor citosolice slabe (n = 6), obeze/supraponderale (n = 6) și obezi morbid (n = 6) (100 μg/gel). Aceste geluri bidimensionale au prezentat profiluri proteice foarte reproductibile între diferiți indivizi și diferite categorii de IMC, indicând un nivel scăzut de variație intraindividuală și experimentală care ar putea confunda interpretarea datelor. Nu au fost detectate modificări semnificative în abundența de proteine ​​între indivizii din fiecare categorie IMC.

Analizele comparative vizuale și ghidate de software ale acestor profiluri proteice bidimensionale au relevat o creștere consistentă a abundenței unui număr de proteine ​​la femeile obeze și obeze morbid, dintre care cea mai izbitoare a fost o proteină ∼22-kDa cu un pI de ∼ 8 care au crescut de 2,9 ori la obezi/supraponderali și de 9,25 ori la mușchi obezi morbid față de subiecții martor slabi. Figura 1B este o vedere extinsă a regiunii gelurilor bidimensionale în care expresia crescută a acestei proteine ​​(ulterior identificată ca AK1) a fost clar arătată la mușchi obezi/supraponderali și obezi morbid.

Activitate AK.

AK este o enzimă importantă în reglarea metabolismului energiei celulare, în special în țesuturile care pot experimenta modificări rapide ale fluxului de energie (17). Pentru a determina dacă modificările proteinei AK1 reflectă modificările activității enzimatice totale AK, am măsurat activitatea AK în mușchiul a patru femei slabe, patru obeze/supraponderale și patru femei obeze morbid (Tabelul 2).

Activitatea totală a mușchilor slabi AK a fost semnificativ mai mică la mușchi de la femeile slabe (1.430 ± 376 nmol ATP · min -1 -1 mg mg proteină -1) decât la persoanele obeze/supraponderale (2.668 ± 387 nmol ATP · min -1 -1 mg proteine ​​-1 ) cu 90% (P = 0,02), în timp ce la mușchi obezi morbid, activitatea AK a fost crescută (2.873 ± 555 nmol ATP · min -1 -1 mg mg proteină -1) 100% (P = 0,04) comparativ cu subiecții martor slabi. Disparitatea dintre creșterea conținutului de proteine ​​și activitatea enzimatică pentru AK1 se poate datora dificultăților descrise anterior în estimarea proteinei musculare totale și/sau îmbogățirea preferențială a AK1 utilizând metoda de extracție digitonină.

Activitatea CK.

Ca și în cazul AK, CK contribuie semnificativ la echilibrul raporturilor nucleotidice și la reglarea metabolismului energetic în mușchiul scheletic (17). De asemenea, s-a demonstrat că activitatea CK răspunde reciproc la activitatea și cantitatea de AK1 și invers în mușchii scheletici și cardiaci umani și șoareci (9: 18-21). Prin urmare, am decis să analizăm activitatea CK totală în mușchiul scheletic din aceeași cohortă de subiecți pentru a stabili dacă se poate observa o tendință reciprocă similară (Tabelul 2). Activitatea CK totală din mușchiul slab (n = 4) a fost de 7.826 ± 603 nmol ATP · min -1 -1 mg proteină -1, în timp ce activitatea CK totală a crescut cu 30% până la 9.830 ± 440 nmol ATP · min -1 -1 mg proteină -1 în mușchi obez (n = 4, P = 0,02) și apoi a scăzut înapoi la 8 907 ± 270 nmol ATP · min -1 -1 mg mg proteină -1 în mușchi obez morbid.

DISCUŢIE

Contribuția la nivelurile epidemice actuale de obezitate din populație sunt obiceiurile noastre alimentare sau ad libitum și nivelurile de activitate fizică în scădere. S-a speculat că acești factori de mediu demască o genetică susceptibilă la obezitate, în special la acei indivizi cu un genotip metabolic de economisire (11,13). Indiferent de cauză, obezitatea este un factor de risc independent pentru dezvoltarea bolilor cardiovasculare, a rezistenței la insulină și a eventualei apariții a diabetului de tip 2 (13).

Mușchiul scheletic contribuie în mod semnificativ la menținerea substratului sistemic și a echilibrului energetic și, atunci când acest echilibru se pierde, la fiziopatologia bolilor legate de obezitate (2-6,10,11,22,23). Acest lucru face din mușchi un organ țintă atractiv pentru identificarea biomarkerilor diagnostici pentru debutul și progresia acestor stări de boală. Rezultatele acestui studiu oferă informații suplimentare despre modificările enzimelor metabolice din mușchi de la persoanele obeze care utilizează profilarea proteinelor.

Ne-a surprins inițial faptul că activitatea CK a crescut cu 30% la femeile obeze/supraponderale, deoarece ne așteptam ca o activitate mai mică a CK să urmeze creșterea activității AK în mușchiul obez. O creștere a activității CK a fost, de asemenea, neașteptată, deoarece nu am detectat nicio modificare semnificativă a proteinei CK M (Tabelul 1); cu toate acestea, cuantificarea acestui spot a fost dificilă, deoarece a fost prezentă la niveluri saturante (datele nu sunt prezentate). De asemenea, este posibil ca creșterea activității CK la nivelul mușchilor femeilor obeze să fie rezultatul modificărilor post-translaționale sau a efectelor alosterice asupra activității enzimei. Presupunem că reducerea conținutului și funcționarea mitocondrială a mușchilor cu creșterea obezității ar reduce randamentul total al ATP celular, necesitând AK crescute, CK și enzimele glicolitice (20). De asemenea, este posibil ca creșteri ale AK1, aldolazei A și GAPDH să poată fi asociate cu diferențe raportate în tipul de fibre musculare cu obezitate (4.22). Acest lucru este susținut de faptul că AK1 este considerat a fi exprimat preferențial în fibre musculare glicolitice (cu contracție rapidă) (21).

Producția de AMP este deosebit de importantă, deoarece este un puternic activator alosteric al numeroaselor enzime glicolitice și al protein kinazei AMP-activate (AMPK) (26,27). AMPK activat joacă un rol cheie în reglarea homeostaziei energetice, în special în reglarea absorbției atât a glucozei, cât și a acizilor grași (26,27). Deoarece activitatea AK este responsabilă în primul rând de producerea AMP în contractarea activă a mușchilor scheletici, speculăm că activitatea AK crescută ar putea duce la modificarea nivelurilor de AMP intracelulare la nivelul mușchilor de la femeile obeze și cu obezitate morbidă. În viitorul apropiat, intenționăm să investigăm rolul AMPK în reglarea țintelor metabolice din aval, cum ar fi acetil-CoA carboxilaza și reglarea expresiei genelor în mușchi de la indivizi obezi și obezi morbid.

Pe scurt, proteinele AK1, aldolaza A și GAPDH sunt crescute la mușchii scheletici obezi/supraponderali și obezi morbid la femei în raport cu subiecții martor slabi. Se presupune că aceste modificări compensează scăderea progresivă a funcției mitocondriale musculare la indivizii obezi, care în timp și în absența intervenției dietetice și a exercițiilor fizice, contribuie la pierderea homeostaziei glucozei și a lipidelor și la eventuala dezvoltare a obezității. boli asociate, cum ar fi diabetul de tip 2.

Modele bidimensionale de gel ale proteinelor citosolice de la mușchiul slab, obez/supraponderal și obez morbid rectus abdominus. A: Profiluri proteice bidimensionale reprezentative ale mușchiului obez slab/supraponderal și obez morbid în care 100 μg de extract proteic au fost separate prin pI pe o bandă cu gradient de pH 3-10 și apoi cu greutatea moleculară pe un SDS-PAGE de 8-15% gel. B: O vedere extinsă a acelorași geluri bidimensionale care arată o expresie crescută a AK1 la femeile obeze și obeze morbid. Localizarea AK1 în gel () este în concordanță cu greutatea moleculară cunoscută (22 kDa) și pI (∼8) ale acestei proteine. Proteinele au fost vizualizate folosind o pată coloidală Coomassie.

Identificarea AK1 de către MALDI-TOF. A: Amprenta digitală de masă triptică MALDI-MS a AK1 din digestia în gel a unei pete folosind pata Coomassie. B: fragmentarea MALDI-TOF a unui ion peptidic unic la m/z 1250,8 Da din același digest triptic în gel dezvăluie identificarea corectă a acestei peptide, care este unică pentru AK1.

Proteine ​​exprimate diferențial și de control, modificarea calculată a pliurilor lor, modificarea valorilor P ale valorii, pI teoretic și experimental și greutatea moleculară

Activitate totală AK și CK în mușchiul slab, obez/supraponderal și obez morbid

Mulțumiri

J.A.H. a primit Institutul Național de Sănătate Grant DK-56112. D.S.H. a primit sprijin din partea președintelui A. James Clark Endowed. E.P.H. a primit sprijin din partea președintelui A. James Clark dotat, Fundația Parsons Family, și Institutul Național de Programe de Sănătate în Aplicații Genomice Grant NHLBI U01-HL-66614.

Mulțumim lui Arjun Prassad pentru asistența sa tehnică valoroasă.