ABSTRACT

INTRODUCERE

Datele de susceptibilitate in vitro sugerează că proteinele antifungice cu greutate moleculară mică, bogate în cisteină și proteine ​​cationice (crAFP) secretate de ascomicete filamentoase sunt potențiali candidați terapeutici pentru combaterea infecțiilor cu Candida (8-13). În studiul nostru anterior, am demonstrat că unul dintre reprezentanții lor, proteina antifungică Neosartorya fischeri 2 (NFAP2), inhibă în mod eficient creșterea Candida spp relevantă clinic. utilizând metoda de testare a susceptibilității clinice M27-A3 a Institutului de standarde clinice și de laborator (CLSI) standardizat și interacționează sinergic cu FLC in vitro (12). Aceste observații indică eficacitatea in vivo și aplicabilitatea potențială a NFAP2 ca agent mono- sau politerapeutic în terapia anti-Candida.

Pentru a demonstra această ipoteză, în prezentul studiu, am investigat aplicabilitatea in vivo a NFAP2 pentru tratamentul VVC. În primul rând, am determinat eficacitatea in vitro a uciderii celulelor și mecanismul antifungic al NFAP2 împotriva unei tulpini C. albicans rezistente la FLC și formatoare de biofilm izolate dintr-un caz VVC uman, înainte de testarea citotoxicității in vitro a NFAP2 pe keratinocite umane primare (HKC) și fibroblaste dermice umane (HDF). Pe baza rezultatelor promițătoare in vitro, am aplicat cu succes NFAP2 singur și în combinație cu FLC într-un sistem de model VVC murin in vivo.

REZULTATE

Sensibilitate in vitro. În lucrările noastre anterioare, am observat că eficacitatea antifungică și MIC ale NFAP2 depind de mediul de testare aplicat și de tulpina de Candida investigată (10, 12). Unul dintre factorii majori de virulență ai C. albicans este capacitatea de a forma un biofilm, care prezintă o sensibilitate mai mică sau o rezistență intrinsecă la agenții antifungici convenționali. În plus, formarea unui biofilm joacă un rol în colonizarea suprafețelor mucoasei (14). Prin urmare, am determinat MIC-urile exacte ale FLC și NFAP2 pentru celulele biofilm planctonice și sesile ale C. albicans 27700 în mediu RPMI 1640 simulând mediul extracelular uman în compoziție. Valorile MIC ale FLC s-au dovedit a fi 16 μg/ml și 512 μg/ml pentru populațiile de celule planctonice și, respectiv, sesile. Conform punctelor de întrerupere a sensibilității (15), C. albicans 27700 este rezistent la FLC. Ambele tipuri de celule au prezentat aceeași susceptibilitate la NFAP2, cu MIC de 800 μg/ml. Este de remarcat faptul că 400 μg/ml NFAP2 a provocat deja o scădere> cu 50% a turbidității și a activității metabolice pentru celulele planctonice. La această concentrație, NFAP2 a fost inactiv împotriva biofilmului și nu au fost observate scăderi semnificative ale turbidității și ale activității metabolice.

Microscopie electronică de scanare a celulelor C. albicans 27700 după incubare în mediu RPMI 1640 (A și B) și în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 800 μg/ml NFAP2 (C și D) timp de 24 ore la 30 ° C cu agitare continuă la 160 rpm . Regiunile încadrate în panourile A și C sunt prezentate la o mărire mai mare în panourile B și respectiv D. Săgețile indică formarea porilor în învelișul celulei și pierderea conținutului celular după expunerea la NFAP2. Bare, 1 μm.

Spectre ECD ale NFAP2 în ddH2O (albastru) și în prezența celulelor C. albicans imediat după expunerea la (roșu) și după 24 de ore de incubație cu (verde) 100 μg/ml NFAP2 la 30 ° C cu agitare continuă la 160 rpm.

Citotoxicitate in vitro. Predicția in silico a arătat o afinitate mare de legare a NFAP2 pentru albumina serică umană (HSA) (ΔG = -12,16 kcal/mol; Kd [constantă de disociere] = 1,21e - 09 M) (20); prin urmare, aplicarea sa sistemică ca medicament antifungic este discutabilă. Cu toate acestea, NFAP2 este considerat un potențial candidat pentru un nou agent antifungic local, iar cea mai posibilă aplicație terapeutică este în tratamentul candidozei superficiale (12). Pentru a verifica această sugestie, este necesar să se elucideze potențialul citotoxic al proteinei pe HKC și HDF ca tipuri de celule predominante în epidermă și cele mai comune celule ale țesutului conjunctiv care sintetizează matricea extracelulară și respectiv colagenul. Colorarea viabilității in vitro a HKC-urilor primare și a HDF-urilor cu PI după expunerea la NFAP2 timp de 24 de ore nu a arătat nicio modificare a numărului de celule PI-pozitive chiar și după tratamentul cu MIC de două ori (vezi Fig. S2 în materialul suplimentar).

Eficacități in vivo ale NFAP2, fluconazol (FLC) și combinația acestora în modelul de vulvovaginită murină. Barele reprezintă media ± SEM (erori standard ale mijloacelor) ale sarcinilor țesutului vaginal ale șoarecilor BALB/c infectați intravaginal cu izolatul C. albicans 27700 rezistent la FLC. Diferențe semnificative (valori P) între numerele CFU au fost determinate pe baza comparației cu controalele netratate. Alte valori de semnificație existente între diferitele tratamente sunt prezentate în Tabelul S2 din materialul suplimentar. Sunt indicate nivelurile diferențelor semnificative (*, P ≤ 0,05; **, P ≤ 0,005).

Histologie. Colorarea cu metenamină-azotat de argint (GMS) Grocott-Gömöri a relevat prezența formelor de drojdie și pseudohipale ale celulelor Candida în țesuturile vaginale ale șoarecilor infectați (Fig. 4A până la D). Cu toate acestea, o scădere a numărului de celule fungice a fost observabilă atunci când animalele au fost tratate cu NFAP2 sau combinația NFAP2-FLC (Fig. 4C și D) în comparație cu grupurile netratate și tratate cu FLC (Fig. 4A și B). O reacție inflamatorie indicată de granulocite neutrofile a fost observată la toate probele colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) (Fig. 4), dar a fost mai moderată la animalele tratate cu NFAP2 și NFAP2-FLC (Fig. 4C și D) decât la grupurile netratate și tratate cu FLC (Fig. 4A și B). Inflamația vaginală detectată la șoarecii neinfectați ar fi putut fi consecința tratamentului anterior cu valerat de estradiol (Fig. 4E) (21).

(A la D) Investigație histologică a țesutului vaginal de la șoareci care suferă de candidoză vulvovaginală fără tratament (A) și cu tratament topic cu 5 mg/kg/zi FLC (B), 800 μg/ml NFAP2 (C) și combinația de 5 mg/kg/zi FLC și 800 μg/ml NFAP2 (D). (E) Țesutul vaginal al șoarecilor neinfectați. Țesuturile vaginale au fost colorate cu GMS (stânga) și H&E (dreapta). Săgețile albastre indică prezența 27700 celule C. albicans (imagini din stânga) și granulocite neutrofile (imagini din dreapta). Bare, 50 μm.

DISCUŢIE

crAFP-urile (cum ar fi proteina antifungică Aspergillus giganteus asociată cu NFAP2 [AFP] și proteina antifungică Penicillium chrysogenum [PAF]) prezintă un interes deosebit în lupta împotriva infecțiilor fungice, deoarece prezintă activitate de inhibare a creșterii in vitro împotriva agenților patogeni fungici și sunt netoxice pentru celulele mamiferelor (22, 23). Cu toate acestea, capacitatea lor puternică în silico-prezisă de a se lega de HSA (ΔG = -13,52 kcal/mol și Kd = 1,22e - 10 M pentru AFP; ΔG = -11,09 kcal/mol și Kd = 7,33e - 09 M pentru PAF) diminuează așteptările pentru aplicarea sistemică (20). În acest studiu, oferim pentru prima dată informații despre eficacitatea antifungică in vivo a unui crAFP ca agent topic pentru tratamentul infecției mucoasei cauzate de C. albicans, o drojdie oportunistă umană-patogenă.

Înainte de prezentul studiu, interacțiunea sinergică in vitro descrisă anterior între NFAP2 și FLC împotriva izolatelor de Candida a sugerat potențialul politerapeutic al proteinei (12). Rezultatele noastre din experimentele de model VVC murin in vivo confirmă în mod clar că aplicarea combinată a NFAP2 și FLC este mai eficientă împotriva izolatului de C. albicans rezistent la FLC implicat decât tratamentul cu cei doi compuși singuri (Fig. 3). Acest rezultat sugerează o interacțiune in vivo pozitivă între ele în țesutul vaginal și inversarea rezistenței la FLC. Similar cu descoperirile noastre, un rezultat mai bun a fost observat într-un model de aspergiloză pulmonară murină atunci când PAF a fost combinat cu amfotericină B (AMB); și anume, combinația PAF-AMB a prelungit supraviețuirea animalelor și a scăzut scorul leziunilor pulmonare comparativ cu aplicația monoterapeutică (35).

Având în vedere rezultatele noastre in vivo prezentate în acest studiu și faptul că NFAP2 recombinant poate fi produs în cantități mari de microorganismul P. chrysogenum considerat în general sigur (GRAS) (12), această proteină oferă o bază fezabilă pentru a dezvolta un nou agent topic pentru tratamentul candidozei superficiale cauzate de tulpini Candida rezistente la medicamente.

MATERIALE ȘI METODE

Tulpini și medii. Tulpina C. albicans 27700, rezistentă la FLC și formând biofilm, bine caracterizată anterior, izolată dintr-un caz de candidoză vulvovaginală umană, a fost utilizată în experimente (36). S-a menținut pe slanți de extract de drojdie-agar glucoză cu KH2PO4 (YEGK) la 4 ° C. Celulele primare HKC și HDF au fost izolate și crescute în mediu bazal CellnTec (CnT-BM.1; CellnTec, Berna, Elveția) și, respectiv, mediu R10, așa cum s-a descris anterior (37). CFU au fost determinate pe plăci de agar cu extract de drojdie-peptonă-dextroză (YPD) și Sabouraud dextroză (SD). Testele de sensibilitate antifungică in vitro au fost efectuate în mediu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) suplimentat cu 0,03% (greutate/vol) l-glutamină și tamponat la pH 7,0 cu acid 4-morfolinopropanesulfonic 0,1665 M (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Compozițiile medii sunt listate în Tabelul S1 din materialul suplimentar.

Producerea și purificarea proteinelor. NFAP2 recombinant a fost produs de Penicillium chrysogenum și purificat prin cromatografie cu schimb de cationi așa cum s-a descris anterior (12). Pentru a exclude efectele oricărui compus contaminant în timpul experimentelor, NFAP2 a fost în continuare purificat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă semipreparativă (RP-HPLC) pe un aparat Shimadzu-Knauer (Kyoto, Japonia) pentru a atinge 100% puritate (vezi Fig . .S3 în materialul suplimentar). S-a aplicat următorul sistem de solvenți: 0,1% (vol/vol) acid trifluoroacetic (TFA) (solvent A) și 80% (vol/vol) acetonitril plus 0,1% (vol/vol) TFA (solvent B). Un gradient liniar de la 0% la 30% (vol/vol) solvent B peste 60 de minute a fost folosit la un debit de 4 ml/min. Vârfurile au fost detectate la 220 nm. Puritatea NFAP2 a fost verificată prin RP-HPLC analitică pe un instrument HPLC din seria Agilent 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) utilizând același sistem de solvent ca cel pentru purificare de la 15% la 30% (vol/vol) solvent B peste 15 minute la un debit de 1 ml/min.

SEM. C. albicans 27700 celule (1 × 107 celule) au fost tratate cu NFAP2 la MIC (800 μg/ml) așa cum este descris mai sus pentru analiza FACS. Celulele netratate au servit drept martori pozitivi ai fenotipului. Opt microlitri de suspensii celulare din PBS au fost depistați pe un disc de siliciu acoperit cu 0,01% polilizilină (Merck Millipore, Billerica, MA, SUA), iar celulele au fost apoi fixate adăugând ușor 2,5% (vol/vol) glutaraldehidă și tampon cacodilat 0,05 M (pH 7,2) în PBS (pH 7,4) timp de 1 oră. După aceea, discurile au fost spălate de două ori cu PBS (pH 7,4) și deshidratate cu o serie de etanol gradat (30%, 50%, 70%, 80% și 100% [vol/vol] etanol, fiecare timp de 15 minute la cameră temperatura). Probele au fost uscate cu un uscător cu punct critic Quorum K850 (Quorum Technologies, Laughton, East Sussex, Marea Britanie), urmat de o acoperire cu aur de 12 nm și observate sub un microscop electronic de scanare JEOL JSM-7100F/LV (JEOL Ltd., Tokyo, Japonia).

Spectroscopie ECD. C. albicans 27700 de celule au fost spălate de două ori și resuspendate în apă dublu distilată (ddH2O) sau într-o soluție apoasă de NFAP2 (100 μg/ml) la o concentrație finală de 107 celule/ml. Măsurătorile spectroscopice ECD ale acestor probe și o soluție apoasă de NFAP2 (100 μg/ml) au fost efectuate în domeniul lungimii de undă de la 185 la 260 nm folosind un spectropolarimetru JASCO-J815 (JASCO, Tokyo, Japonia). Spectrele au fost colectate la 25 ° C cu o viteză de scanare de 100 nm/s folosind o cuvă de cuarț cu o lungime de 0,1 cm. Spectrele prezentate sunt acumulări de 10 scanări pentru fiecare probă. Achizițiile de spectru s-au făcut după 0 și 24 de ore de incubare a probelor la 30 ° C sub agitare continuă la 160 rpm. După măsurători spectroscopice, s-a determinat CFU al probelor tratate și netratate cu NFAP2. Acest experiment a fost repetat de două ori.

Determinarea CFU. După măsurători ECD, celulele au fost colectate prin centrifugare (17.000 × g timp de 2 minute) și spălate de două ori cu mediu YPD, iar diluțiile seriale de 10 ori au fost apoi preparate în cinci etape în 1 ml YPD. Suspensiile celulare de o sută de microlitri din ultimele trei etape au fost răspândite pe plăcile de agar YPD în trei replici. Numărul de colonii a fost numărat după incubare timp de 24 de ore la 30 ° C.

Histologie. Vaginele șoarecilor diferiți dar tratați identic au fost implicate în investigații histologice așa cum s-a descris mai sus. Examenul histopatologic și colorarea histochimică au fost efectuate pe țesuturile vaginale de șoarece de rutină fixate în formalină, cu parafină. Secțiunile seriale cu grosimea de 4 μm au fost tăiate din blocuri de parafină și s-a efectuat colorarea de rutină GMS și H&E (45).

Analiza in silico. Capacitatea NFAP2 de a se lega de HSA (nr. De acces UniProt nr. A0A1D0CRT2 și respectiv P02768 [46]) a fost prezisă de serverul PPA-Pred2 (Protein-Protein Affinity Predictor) (20).

Analize statistice. Datele FACS și CFU după experimentele ECD au fost analizate utilizând software-ul Microsoft Excel 2010 (Microsoft, Edmond, WA, SUA), iar testul t cu două eșantioane a fost utilizat pentru a determina valorile de semnificație. Sarcina vaginală a fost analizată folosind un test Kruskal-Wallis cu testul post Dunn pentru comparații multiple utilizând software-ul GraphPad Prism versiunea 6.05 (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA). Semnificația a fost definită ca o valoare P a primit la 21 august 2018.

  • Returnat pentru modificare 26 octombrie 2018.
  • Acceptat la 12 noiembrie 2018.
  • Manuscris acceptat postat online 26 noiembrie 2018.

    • neosartorya