Eșantioane histologice de ventricule cardiace la șobolani din grupurile martor și experimentale. (a) control, grupa 1; (b) pretratarea cronică a astaxantinei (AST), grupa 2; (c) injecție cu izoproterenol (ISO), grupa 3; (d) injecție ISO și pretratare cronică AST, grupa 4. Microscopie cu lumină; figurile principale prezintă probe colorate cu hematoxilină și eozină (H&E, nucleele celulare sunt colorate în albastru, eritrocitele sunt colorate în roșu, iar țesutul muscular este colorat în roz); inserții interne: colorarea tricromului Masson (colagenul/fibroza este colorat în albastru, mușchii și alte țesuturi sunt colorate în roșu, nucleele celulare sunt colorate în maro).

Efectul administrării AST și ISO asupra nivelului subunităților complexelor lanțului respirator mitocondrial în mitocondriile inimii șobolanilor. Probele de proteine ​​au fost extrase și supuse Western blot. Modificări ale complexelor mitocondriale au fost detectate folosind un cocktail de anticorpi Total OXPHOS Rodent WB. Imunodetectarea Tom20 a fost utilizată ca control de încărcare. (a) Imunomarcarea cu cocktailul anticorp OXPHOS și Tom20; (b - f) Cuantificarea imunocolorării prin densitometrie asistată de computer (subunitatea α a complexului V (CV-ATP5A-55 kDa), subunitatea complexă a citocromului b-c1 2 a complexului III (CIII-UQCRC2-48 kDa), citocrom codat mitocondrial subunitatea c oxidază I a complexului IV (CIV-MTCO1-40 kDa), subunitatea succinat dehidrogenază [ubiquinonă] fier-sulf a complexului II (CII-SDHB-30 kDa) și dehidrogenază [ubiquinonă] 1 β subunitatea subcomplexă 8 a complexului I (CI-NDUFB820 kDa), respectiv). Graficele cu bare reprezintă nivelurile complexelor adecvate (I - V); datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. * p p Materiale suplimentare, p. 1).

Efectul administrării AST și ISO asupra conținutului proteinelor mitocondriale: ciclofilină D (CyP-D), translocator de adenină nucleotidă (ANT), 2 ′, 3′-nucleotidă ciclică-3′-fosfodiasterază (CNPază) și superoxid dismutază 2 (SOD-2). (a) Partea superioară: Western blots colorate cu anticorpii corespunzători (CNPase, ANT și CyP-D); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările conținutului de proteine ​​în unități absolute normalizate la COX IV. (b) Partea superioară: Western blots colorate cu anticorpul împotriva SOD-2; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările conținutului de SOD-2 în unități absolute normalizate la COX IV. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 2).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului I (CI) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probe de electroforeză nativă albastră (BNE) (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE, iar gelul a fost colorat pentru detectarea activității CI printr-un tampon conținând 100 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,14 mM NADH, 1 mg/ml NBT (nitro albastru tetrazoliu) pentru

10-30 min; partea inferioară, o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CI; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpul policlonal împotriva ANT1 și anticorpii monoclonali împotriva CyP-D și NDUFB8 (NADH dehidrogenază [ubiquinonă] 1 subunitate beta subcomplexă 8 din CI); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 3).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului IV (CIV) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat pentru detectarea activității CIV printr-un tampon conținând 10 mM KH2PO4 (pH 7,4), 1 mg/ml DAB (3,3'-Diaminobenzidină) și 0,2 mg de citocrom c timp de 1 oră; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CIV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpii monoclonali împotriva COXIV și MTCO1; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 4).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului II (CII) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probele de BNE (secțiunea Material și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat pentru detectarea activității CII printr-un tampon conținând 50 mM KH2PO4 (pH 7,4), 84 mM succinat, 0,2 mM PMS (fenazină metosulfat) și 2 mg/ml NBT; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CIV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție utilizând anticorpul monoclonal împotriva SDHB (succinat dehidrogenază [ubiquinonă] subunitate fier-sulf din CII); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelului de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 5).

Efectul AST și ISO asupra nivelului de proteine ​​asociate cu complexul III (CIII) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate în tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate de 1D BNE, iar benzile excizate au fost supuse 2D SDS-PAGE; (b) partea superioară: Western blot colorată cu anticorpi monoclonali împotriva UQCRC2 (subunitatea complexului 2 citocrom b-c1) și CNPază; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 6).

Efectul AST și ISO asupra activității ATP sintazei în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate în tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat timp de 16 ore pentru detectarea activității complexului V (CV) printr-un tampon conținând 10 mM ATP, 35 mM Tris (HCL), 270 mM glicină, 14 mM MgSO4 și 0,2% Pb (NO3) 2; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpi monoclonali împotriva subunităților α (ATP5A), c (ATP5G), b (ATP5F1) și CyP-D; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 7).

Abstract

antioxidanți

Eșantioane histologice de ventricule cardiace la șobolani din grupurile martor și experimentale. (a) control, grupa 1; (b) pretratarea cronică a astaxantinei (AST), grupa 2; (c) injecție cu izoproterenol (ISO), grupa 3; (d) injecție ISO și pretratare cronică AST, grupa 4. Microscopie cu lumină; figurile principale prezintă probe colorate cu hematoxilină și eozină (H&E, nucleele celulare sunt colorate în albastru, eritrocitele sunt colorate în roșu, iar țesutul muscular este colorat în roz); inserții interne: colorarea tricromului Masson (colagenul/fibroza este colorat în albastru, mușchii și alte țesuturi sunt colorate în roșu, nucleele celulare sunt colorate în maro).

Efectul administrării AST și ISO asupra nivelului subunităților complexelor lanțului respirator mitocondrial în mitocondriile inimii șobolanilor. Probele de proteine ​​au fost extrase și supuse Western blot. Modificări ale complexelor mitocondriale au fost detectate folosind un cocktail de anticorpi Total OXPHOS Rodent WB. Imunodetectarea Tom20 a fost utilizată ca control de încărcare. (a) Imunomarcarea cu cocktailul anticorp OXPHOS și Tom20; (b - f) Cuantificarea imunocolorării prin densitometrie asistată de computer (subunitatea α a complexului V (CV-ATP5A-55 kDa), subunitatea complexă a citocromului b-c1 2 a complexului III (CIII-UQCRC2-48 kDa), citocrom codat mitocondrial subunitatea c oxidază I a complexului IV (CIV-MTCO1-40 kDa), subunitatea succinat dehidrogenază [ubiquinonă] fier-sulf a complexului II (CII-SDHB-30 kDa) și dehidrogenază [ubiquinonă] 1 β subunitatea subcomplexă 8 a complexului I (CI-NDUFB820 kDa), respectiv). Graficele cu bare reprezintă nivelurile complexelor adecvate (I - V); datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. * p p Materiale suplimentare, p. 1).

Efectul administrării AST și ISO asupra conținutului proteinelor mitocondriale: ciclofilină D (CyP-D), translocator de adenină nucleotidă (ANT), 2 ′, 3′-nucleotidă ciclică-3′-fosfodiasterază (CNPază) și superoxid dismutază 2 (SOD-2). (a) Partea superioară: Western blots colorate cu anticorpii corespunzători (CNPase, ANT și CyP-D); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările conținutului de proteine ​​în unități absolute normalizate la COX IV. (b) Partea superioară: Western blots colorate cu anticorpul împotriva SOD-2; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările conținutului de SOD-2 în unități absolute normalizate la COX IV. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 2).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului I (CI) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probe de electroforeză nativă albastră (BNE) (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE, iar gelul a fost colorat pentru detectarea activității CI printr-un tampon conținând 100 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,14 mM NADH, 1 mg/ml NBT (nitro albastru tetrazoliu) pentru

10-30 min; partea inferioară, o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CI; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpul policlonal împotriva ANT1 și anticorpii monoclonali împotriva CyP-D și NDUFB8 (NADH dehidrogenază [ubiquinonă] 1 subunitate beta subcomplexă 8 din CI); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 3).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului IV (CIV) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat pentru detectarea activității CIV printr-un tampon conținând 10 mM KH2PO4 (pH 7,4), 1 mg/ml DAB (3,3'-Diaminobenzidină) și 0,2 mg de citocrom c timp de 1 oră; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CIV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpii monoclonali împotriva COXIV și MTCO1; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 4).

Efectul AST și ISO asupra activității complexului II (CII) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate într-un tampon pentru probele de BNE (secțiunea Material și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat pentru detectarea activității CII printr-un tampon conținând 50 mM KH2PO4 (pH 7,4), 84 mM succinat, 0,2 mM PMS (fenazină metosulfat) și 2 mg/ml NBT; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CIV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție utilizând anticorpul monoclonal împotriva SDHB (succinat dehidrogenază [ubiquinonă] subunitate fier-sulf din CII); partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelului de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 5).

Efectul AST și ISO asupra nivelului de proteine ​​asociate cu complexul III (CIII) în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate în tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate de 1D BNE, iar benzile excizate au fost supuse 2D SDS-PAGE; (b) partea superioară: Western blot colorată cu anticorpi monoclonali împotriva UQCRC2 (subunitatea complexului 2 citocrom b-c1) și CNPază; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 6).

Efectul AST și ISO asupra activității ATP sintazei în mitocondriile inimii șobolanilor. (a) Partea superioară: mitocondriile de șobolan proaspăt preparate izolate din fiecare grup au fost solubilizate în tampon pentru probele de BNE (secțiunea Materiale și metode). Probele mitocondriale au fost separate prin 1D BNE și gelul a fost colorat timp de 16 ore pentru detectarea activității complexului V (CV) printr-un tampon conținând 10 mM ATP, 35 mM Tris (HCL), 270 mM glicină, 14 mM MgSO4 și 0,2% Pb (NO3) 2; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările activității CV; (b) partea superioară: benzile excizate cu activitate enzimatică au fost supuse 2D SDS-PAGE și șterse pe nitroceluloză pentru imunodetecție folosind anticorpi monoclonali împotriva subunităților α (ATP5A), c (ATP5G), b (ATP5F1) și CyP-D; partea inferioară: o diagramă care reflectă cantitativ modificările nivelurilor de proteine. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD pentru patru experimente independente. * p p Materiale suplimentare, p. 7).