Afiliere Facultatea de Medicină a Universității Washington, Departamentul de Pediatrie, St. Louis, Missouri, Statele Unite ale Americii

astrovirusul

Afiliere Facultatea de Medicină a Universității Washington, Departamentele de Microbiologie Moleculară și Patologie și Imunologie, St. Louis, Missouri, Statele Unite ale Americii

Afiliere Christian Medical College, Departamentul de Științe Gastrointestinale, Vellore, India

Afiliere Christian Medical College, Departamentul de Științe Gastrointestinale, Vellore, India

Afiliere Facultatea de Medicină a Universității Washington, Departamentele de Microbiologie Moleculară și Patologie și Imunologie, St. Louis, Missouri, Statele Unite ale Americii

  • Lori R. Holtz,
  • Irma K. Bauer,
  • Priya Rajendran,
  • Gagandeep Kang,
  • David Wang

Abstract

Astrovirusurile sunt o cauză cunoscută a diareei umane. Recent, astrovirusul extrem de divergent MLB1 (MLB1) a fost identificat într-o probă de scaun de la un pacient cu diaree. Ulterior, a fost detectat în scaun de la indivizi cu și fără diaree. Pentru a determina dacă MLB1 este asociat cu diaree, am efectuat un studiu de control al cazului MLB1. În paralel, prevalența astrovirusurilor umane clasice (HAstV) a fost, de asemenea, determinată în aceeași cohortă de control de caz. 400 de cazuri și 400 de controale pereche dintr-o cohortă longitudinală de naștere din Vellore, India au fost analizate prin RT-PCR. În timp ce HAstVs au fost asociate cu diaree (p = 0,029) în această cohortă, MLB1 nu a fost; 14 dintre controale și 4 cazuri au fost pozitive pentru MLB1. Mai mult, încărcătura virală MLB1 nu a diferit semnificativ între cazuri și controale. Rolul MLB1 în sănătatea umană rămâne încă necunoscut și sunt necesare studii viitoare.

Citare: Holtz LR, Bauer IK, Rajendran P, Kang G, Wang D (2011) Astrovirusul MLB1 nu este asociat cu diareea într-o cohortă de copii indieni. PLoS ONE 6 (12): e28647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028647

Editor: Leo L. M. Poon, Universitatea din Hong Kong, Hong Kong

Primit: 25 octombrie 2011; Admis: 11 noiembrie 2011; Publicat: 9 decembrie 2011

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută parțial de Institutul Național de Sănătate (NIH)/Centrul Național pentru Resurse de Cercetare Washington University-ICTS numărul de grant KL2 RR024994 și de NIH grant R21 AI090199. DW deține un Investigator în patogenia bolilor infecțioase premiu de la Burroughs Wellcome Fund. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Primul astrovirus care infectează oamenii a fost descris în 1975 [1]. De atunci, au fost identificate un total de 8 serotipuri strâns legate de acest astrovirus original („astrovirusurile umane clasice” (HAstVs)), toate despre care se crede că provoacă diaree. Simptomele diareei durează de obicei 2-4 zile după o perioadă de incubație de 3-4 zile [2]. Aceste infecții afectează cel mai frecvent copii, vârstnici și imunocompromiși [3]. HAstV reprezintă până la ~ 10% din cazurile sporadice de diaree non-bacteriană la copii [4], [5], [6], [7]. Din 2008, cinci astrovirusuri foarte divergente au fost descoperite în exemplare de diaree umană: MLB1 [8], astrovirus MLB2 (MLB2) [9], astrovirus VA1 (VA1) [10], astrovirus VA2 (VA2) [9] și astrovirus VA3 (VA3) [9]. Dintre acești viruși, MLB1 a fost detectat la cea mai mare frecvență. MLB1 a fost identificat pentru prima dată în scaunul unui copil cu diaree inexplicabilă. Ulterior, a fost găsit în scaunele colectate din întreaga lume [9], [11], [12], [13], [14], [15] de la pacienți cu și fără diaree.

Descoperirea noului astrovirus MLB1 la specimenele de scaun de la pacienții cu diaree ridică întrebarea dacă, ca și toate celelalte astrovirusuri umane, provoacă sau nu diaree. Din punct de vedere istoric, dovada cauzalității virusurilor diareegenice s-a bazat pe ingestia de filtre fecale de către voluntari umani [2], [16], [17], [18]. Totuși, astfel de studii nu mai sunt fezabile pentru virusuri noi de patogenitate necunoscută. Astfel, atribuirea patogenității unui virus nou identificat necesită abordări indirecte, cum ar fi infecția modelelor animale surogate sau analize epidemiologice ale populațiilor umane. Aici descriem un studiu de control al cazurilor menit să stabilească dacă MLB1 este sau nu asociat cu diaree.

Materiale și metode

Descrierea probelor

RT-PCR

200 uL dintr-o suspensie fecală de -20% au fost extrase folosind metoda Boom [24] și acidul nucleic total extras a fost eluat în 40 uL de apă. Așa cum s-a descris anterior, a fost utilizată o strategie de screening în două etape pentru a detecta astrovirusurile [9]. Pe scurt, primii de consens astrovirus SF0073 (5'-GATTGGACTCGATTTGATGG-3 ') și SF0076 (5'-CTGGCTTAACCCACATTCC-3'), proiectați pentru ARN polimeraza (ORF 1b) au fost folosiți pentru a examina toate probele în prima etapă. Probele care au fost pozitive în prima fază a screening-ului au fost apoi supuse unor screening-uri RT-PCR suplimentare cu primeri specifici pentru astrovirusurile umane clasice [Mon269 (5′-CAACTCAGGAAACAGGGTGT-3 ′) și Mon270 (5′-TCAGATGCATTGTCATTGGT-3 ′)] [ 25] și primerii specifici pentru MLB1 (SF0053 (5′-CTGTAGCTCGTGTTAGTCTTAACA-3 ′) și SF0061 (5′-GTTCATTGGCACCATCAGAAC-3 ′)], ambii vizați regiunea capsidelor (ORF 2). Ampliconii PCR au fost clonați în pCR4 (Invitrogen) și secvențați utilizând tehnologia standard de secvențiere Sanger.

Analiza filogenetică

Secvențele ampliconilor din regiunea capsidelor din probele pozitive HAstV și MLB1 au fost aliniate utilizând ClustalX1.83. PAUP a fost apoi utilizat pentru a genera arbori de parsimoniu maxim cu 1.000 de replici de bootstrap.

qRT-PCR

Primerii de consens MLB1 (LG0189 5′- AAGTGTGCATATGTTGGGACC -3 ′ și LG0190 5′- CTACACCTCTCCAATTCATG -′3) care vizează un segment de 131 nt din regiunea ORF1a a genomului MLB1 au fost proiectați prin alinierea celor 4 secvențe MLB1 prezente în GenBank 1. FJ402983.1, HM450380.1 și HM989952.1) care conțin regiunea de interes începând cu 23.12.2010; acești primeri au fost utilizați într-un test SYBR verde qRT-PCR. QRT-PCR a fost efectuat folosind kit-ul qScript One-Step (Quanta) după cum urmează: 50 ° C timp de 10 min, 95 ° C timp de 5 min, 45 cicluri de 95 ° C timp de 10 sec și 60 ° C timp de 30 sec, urmat de un curba de topire. Pentru a stabili o curbă standard pentru această analiză, ARN transcris in-vitro a fost generat dintr-o plasmidă care conține nt 1 până la 846 de MLB1 (GenBank NC_011400.1) folosind MAXIscript (Ambion) conform protocolului producătorului. Diluțiile seriale ale acestui ARN transcris in-vitro de la 5 × 106 6 copii la 5 copii au fost utilizate pentru curba standard.

Rezultate

Studiu de control al cazului RT-PCR

Pentru HAstVs, 14 din cele 400 de cazuri au fost pozitive și 4 din cele 400 de controale au fost pozitive. În schimb, pentru MLB1 doar patru dintre cazuri au fost pozitive, în timp ce 14 dintre controale au fost pozitive. Pentru a lua în considerare faptul că unii participanți au fost eșantionați de mai multe ori, modelele de regresie logistică au fost potrivite folosind ecuații de estimare generalizate. HAstV-urile au fost mai susceptibile de a fi prezente în probele diareice decât în ​​probele asimptomatice (OR 3,59, 95% CI 1,14-11,31, p = 0,029), în concordanță cu rezultatele studiilor anterioare [26]. În schimb, MLB1 era mai puțin probabil să fie prezent în probele diareice decât în ​​probele asimptomatice (OR 0,28, 95% CI 0,09-0,89, p = 0,033).

Toate probele RT-PCR pozitive au fost donate și secvențiate (GenBank JN871233 - JN871268). Ampliconii din regiunea capsidelor au fost aleși pentru secvențiere, deoarece aceasta este regiunea cel mai puțin conservată a genomului și ar putea dezvălui cea mai mare divergență. Ampliconii de capsidă MLB1 și-au împărtășit identitatea nucleotidică între 96 și 99%, în timp ce ampliconii de capsidă HAstV și-au împărtășit 77–100% identitate de nucleotide. Analiza filogenetică a ampliconilor HAstV și MLB1 obținute în regiunile capsidei nu a arătat nicio grupare a cazurilor față de martori (date neprezentate). Cinci probe (4 martori și 1 caz) au fost pozitive atât pentru HAstV, cât și pentru MLB1.

Dintre cei 249 de copii studiați, 107 au fost testați în mai multe momente. Un subiect a avut două probe de diaree pozitive pentru HAstV-uri separate cu 14 luni. Scaunul martor intermediar, colectat la 12 luni după prima probă de diaree și cu 7 săptămâni înainte de a doua probă de diaree, de la acest subiect a fost negativ pentru HAstVs. Ampliconii derivați de capsidă din aceste două probe de diaree au împărtășit 78% identitate, sugerând că acest subiect a fost infectat de două serotipuri HAstV diferite în cele două momente de timp. Doi subiecți au avut două scaune asimptomatice pozitive pentru MLB1 cu un eșantion de diaree care a fost negativ pentru MLB1. Pentru un subiect, aceste probe asimptomatice au fost separate cu 18 luni. Ampliconii derivați de capsidă din aceste două eșantioane au împărțit 98% identitate. Pentru celălalt subiect, aceste probe asimptomatice au fost separate de 8 luni și au împărțit 99% identitate. O interpretare a acestei observații este că reinfectarea de către MLB1 este posibilă.

qRT-PCR a probelor pozitive

Probele pozitive pentru MLB1 prin RT-PCR au fost apoi supuse qRT-PCR pentru a stabili dacă sarcina virală diferă între cazuri și controale, așa cum sa descris pentru norovirus [27]. Nu a existat nicio diferență semnificativă în numărul de copii ARN/ml de suspensie fecală între cazuri și controale. În mod specific, pentru cele 4 cazuri, numărul mediu de copii de ARN/ml de suspensie fecală a fost de 7 × 10 3, iar pentru cele 14 probe de control pozitiv, numărul mediu de copii/ml de suspensie fecală a fost de 4 × 10 4. Folosind testul Mann-Whitney, nu a existat o diferență semnificativă între cazuri și controale (p = 0,51).

Discuţie

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: DW GK LRH. Realizarea experimentelor: LRH IKB PR. Analiza datelor: LRH IKB DW. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: GK. Am scris lucrarea: LRH DW.