Autori ‡ Acești autori sunt co-autori comuni în această lucrare.

utilizând

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

Autori ‡ Acești autori sunt co-autori comuni în această lucrare.

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

Afiliații Facultatea de biologie, Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Moscova, Rusia, InsideDNA Ltd., Londra, Regatul Unit

Afiliere InsideDNA Ltd., Londra, Regatul Unit

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

Institutul de Afiliere al Botanicii, Academia Poloneză de Științe, Cracovia, Polonia

Departamentul de afiliere pentru ecologie și evoluție, Universitatea din Lausanne, Lausanne, Elveția

  • Tomasz Suchan,
  • Camille Pitteloud,
  • Nadezhda S. Gerasimova,
  • Anna Kostikova,
  • Sarah Schmid,
  • Nils Arrigo,
  • Mila Pajkovic,
  • Michał Ronikier,
  • Nadir Alvarez

Cifre

Abstract

Citare: Suchan T, Pitteloud C, Gerasimova NS, Kostikova A, Schmid S, Arrigo N, și colab. (2016) Captură de hibridizare utilizând sonde RAD (hyRAD), un nou instrument pentru efectuarea analizelor genomice pe eșantioane de colecție. PLoS ONE 11 (3): e0151651. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151651

Editor: Ludovic Orlando, Muzeul de istorie naturală al Danemarcei, Universitatea din Copenhaga, DANEMARCA

Primit: 19 august 2015; Admis: 2 martie 2016; Publicat: 21 martie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: N. Alvarez și N. Arrigo au fost finanțate din subvențiile Fundației Naționale Elvețiene pentru Știință (PP00P3_144870 și, respectiv, PZ00P3_148224). TS a fost sprijinit de o subvenție de la Société Académique Vaudoise (Elveția). Lucrarea a fost susținută financiar de o subvenție din partea Elveției, prin contribuția elvețiană la Uniunea Europeană extinsă (Programul de cercetare polono-elvețian, proiectul nr. PSPB-161/2010). InsideDNA Ltd a oferit asistență sub formă de salariu pentru NSG. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Rolurile specifice ale acestor autori sunt articulate în secțiunea „contribuțiile autorului”.

Interese concurente: AK este fondatorul platformei insidedna.me (InsideDNA Ltd) utilizată pentru analiza seturilor de date. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale. Ceilalți autori au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Polimorfismul de secvență la locul de restricție al ADN-ului determină o pierdere progresivă a siturilor de restricție partajate între cladele divergente și are ca rezultat alele nule pentru care nu pot fi obținute date de secvență. Această limitare reduce în mod critic numărul loci ortologi care pot fi supravegheați pe ansamblul complet de specimene analizate și conduce la estimări ale diversității genetice părtinitoare [9-11]. Acest fenomen, combinat cu alte probleme tehnice - cum ar fi efectele concurenței cu reacția în lanț a polimerazei (PCR) - este o limitare serioasă a majorității protocoalelor clasice de secvențiere RAD care trebuie abordate.

În plus, protocoalele de secvențiere RAD se bazează pe ADN cu greutate moleculară relativ mare (în special pentru protocolul ddRAD [12]), mai ales că digestia enzimei și selecția mărimii fragmentelor rezultate sunt pașii cheie pentru recuperarea datelor secvenței în loci ortologi. Prin urmare, secvențierea RAD nu poate fi aplicată probelor de ADN degradate, o limitare împărtășită și de metodele clasice de genotipare și secvențierea ampliconului. Colecțiile muzeale, deși cuprind eșantioane care acoperă zone spațiale mari și scări temporale largi, nu asigură neapărat condiții optime pentru conservarea ADN-ului. Ca rezultat, multe specimene de muzeu produc ADN foarte fragmentat - chiar și pentru probele colectate relativ recent [13-15], limitându-le utilizarea pentru ecologie moleculară, genetică de conservare, studii filogeografice și filogenetice [16, 17]. O abordare eficientă din punct de vedere al costurilor și aplicată pe scară largă pentru analizele genomice pe exemplare de muzeu ar permite explorarea colecțiilor biologice deseori unice, de exemplu, cuprinzând taxe/descendențe rare sau acum dispărute sau organisme care apar efemer în habitate naturale și care prezintă probleme pentru prelevare de probe. De asemenea, ar permite studierea schimbărilor temporale în diversitatea genetică folosind colecții istorice, aplicate acum doar într-o mână de cazuri la scară genomică [18].

Metodele de hibridizare-captare au fost recunoscute ca o modalitate promițătoare de a aborda atât reprezentarea alelelor, cât și limitările calității ADN-ului [19, 20]. Totuși, astfel de abordări se bazează pe cunoașterea anterioară a genomului/transcriptomului și până de curând au fost în mare parte limitate la organismele model. Abordând această limitare, dezvoltarea recentă a UltraConserved Elements (UCE [3, 5]) sau îmbogățirea hibridă ancorată [21] metodele bazate pe captură au permis direcționarea loci omologi la scări filogenetice largi folosind un set de sonde. Cu toate acestea, necesită o proiectare consumatoare de timp și o sinteză costisitoare a sondelor pentru captarea secvențelor de ADN de interes. În mod similar, tehnicile de captare a exonilor, aplicate recent în domeniul genomicii muzeelor ​​[18], necesită exemplare proaspete pentru extracția ARN-ului sau sintetizarea sondelor pe baza transcriptomului cunoscut.

Aici, vă prezentăm o abordare numită „hibridizare RAD” (hyRAD), în care fragmentele de ADN, generate folosind protocolul RAD cu dublă digestie (ddRAD [8]) aplicat probelor proaspete, sunt utilizate ca sonde de hibridizare-captare pentru a îmbogăți bibliotecile de puști în fragmentele de interes. Metoda noastră combină astfel simplitatea și costul relativ scăzut al dezvoltării bibliotecilor de secvențiere RAD cu puterea și precizia metodelor de hibridizare-captare. Acest lucru permite utilizarea eficientă a ADN-ului de calitate scăzută și limitează problemele cauzate de succesiunea polimorfismelor la locul restricției. Mai mult decât atât, utilizarea protocoalelor ddRAD standard și a secvențierii puștilor permite aplicarea protocolului hyRAD în laboratoarele care utilizează deja metodele menționate mai sus, pentru un cost redus.

Pe scurt, abordarea hyRAD constă în următorii pași (Fig 1):

  1. generarea unei biblioteci ddRAD bazată pe probe de ADN de înaltă calitate, selectarea mărimii înguste a fragmentelor rezultate și eliminarea secvențelor adaptorului;
  2. biotinilarea fragmentelor rezultate, denumite în continuare sonde;
  3. construirea unei biblioteci de secvențiere a puștii din probe de ADN (fie proaspete, fie degradate ca în exemplarele de muzeu);
  4. captarea hibridizării bibliotecilor de arme rezultate pe sonde;
  5. secvențierea bibliotecilor de puști îmbogățite și opțional a bibliotecii ddRAD (precursor de probe) pentru utilizare ulterioară ca referință;
  6. tratament bioinformatic (Fig 2): asamblarea citirilor în contigs, alinierea la biblioteca ddRAD secvențiată sau ansamblul de novo, apelare SNP.