Daria Skuratovskaia

1 Laborator de imunologie și biotehnologie celulară, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236016, Rusia; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (M.V.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

Larisa Litvinova

1 Laborator de imunologie și biotehnologie celulară, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236016, Rusia; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (M.V.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

Maria Wolf

1 Laborator de imunologie și biotehnologie celulară, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236016, Rusia; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (M.V.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

Pavel Zatolokin

1 Laborator de imunologie și biotehnologie celulară, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236016, Rusia; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (M.V.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

2 Departamentul de Chirurgie Reconstructivă și Endoscopică, Spitalul Regional Kaliningrad, Kaliningrad 236016, Rusia

Konstantin Popadin

3 Centrul pentru genomică funcțională mitocondrială, Institutul sistemelor vii, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236040, Rusia; moc.liamg@nidapopnitnatsnok

4 Center for Integrative Genomics, Universitatea din Lausanne, 1015 Lausanne, Elveția

5 Institutul elvețian de bioinformatică, 1015 Lausanne, Elveția

Ilia Mazunin

1 Laborator de imunologie și biotehnologie celulară, Universitatea federală baltică Immanuel Kant, Kaliningrad 236016, Rusia; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (M.V.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

Date asociate

Abstract

ADN-ul mitocondrial (ADNmt) codifică subunitățile de bază ale complexelor de fosforilare oxidativă și, ca rezultat al diafragmei de reglementare complicate între genomii nucleari și mitocondriale, numărul total de copii ale ADNmt se potrivește cerințelor fiecărui tip de celulă. Abaterile de la numărul fiziologic de copii ADNmt sunt de așteptat să fie dăunătoare și ar putea provoca unele boli moștenite și îmbătrânirea normală. Am studiat 46 de pacienți obezi cu diabet de tip 2 (T2DM) la un an după o gastrectomie laparoscopică cu mânecă (LSG) și bypass gastric Roux-en-Y (RYGB). Rezultatele au fost comparate cu pacienții cu greutate normală fără T2DM (grupul de control 1) (indicele de masă corporală (IMC) = 22,5 ± 3,01 kg/m 2) și pacienții cu obezitate fără T2DM (grupul de control 2) (IMC = 36 ± 3,45 kg )./m 2). Am detectat o creștere a numărului de copii ADNmt în celulele stratului de tampon obținut din sângele periferic, eșantionat la un an după intervenția chirurgicală bariatrică. De asemenea, am constatat că numărul mediu de copii ADNmt, precum și dinamica acestuia (înainte și după operație) sunt specifice sexului. Din câte știm, aceasta este prima dovadă pentru restabilirea numărului de copii mtDNA la pacienții obezi după LSG și RYGB.

1. Introducere

2. Materiale și metode

Acest studiu a inclus 46 de pacienți cu T2DM care erau obezi (11 bărbați și 35 de femei, 47,67 ± 8,6 ani, IMC = 48,1 ± 9,4 kg/m 2). Acești pacienți au fost internați la Spitalul Clinic Regional din Regiunea Kaliningrad pentru tratament chirurgical. Prezența T2DM a fost confirmată pe baza unui examen clinic și instrumental detaliat, utilizând criteriile de diagnostic ale Organizației Mondiale a Sănătății pentru diabetul zaharat și hiperglicemia intermediară (1999-2013).

Pacienții cu T2DM care prezentau obezitate au fost stratificați în grupuri în funcție de tipul de intervenție chirurgicală bariatrică la care au fost supuși: 21 de pacienți au suferit LSG și 25 de pacienți au suferit RYGB. Rezultatele au fost comparate cu donatorii sănătoși cu greutate normală fără T2DM (grupul de control 1) (8 bărbați și 10 femei, 41,8 ± 4,6 ani, IMC = 22,5 ± 3,01 kg/m 2) și pacienții cu obezitate fără T2DM (grupul de control 2) (9 bărbați și 18 femei, 42,8 ± 8,3 ani, IMC = 36 ± 3,45 kg/m 2) pentru a evalua influența prezenței/absenței diabetului de tip 2. Am decis să folosim două grupuri de control deoarece, la un an după operație, pacienții aveau un ADNmt crescut, dar IMC nu atinsese un nivel normal (adică, pacienții cu greutate normală).

Procesul tehnic de efectuare a intervențiilor chirurgicale bariatrice a fost standardizat în conformitate cu recomandările metodice pentru chirurgii bariatric. RYGB a fost efectuat folosind tehnica Lonroth.

Toți participanții la studiu au acordat consimțământul informat pentru a participa la un studiu de cercetare. Studiul a fost realizat în conformitate cu Declarația Asociației Medicale Mondiale (WMA) din Helsinki (2000) și Protocolul la Convenția privind drepturile omului și biomedicină (1999). Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul Etic Local al Parcului de Inovare al Universității Federale Baltice Immanuel Kant (Protocolul nr. 4 din 23 octombrie 2013).

Probele de sânge au fost colectate înainte de intervenția chirurgicală bariatrică și la un an după aceea. ADN-ul a fost extras imediat din toate probele de straturi de sânge periferic, prin QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania), conform instrucțiunilor producătorului. Reacția PCR digitală prin picurare a fost efectuată similar protocolului publicat anterior [11]. Mediatorii metabolismului glucidic (glucoză, hemoglobină glicată (HbA1c)) au fost măsurați pe un analizor biochimic automat CA-180 (Furuno Electric Co., Ltd, Nishinomiya, Japonia). Determinarea cantitativă a insulinei, a grelinei, a inhibitorilor gastrici polipeptidici (GIP), a peptidei de tip glucagon-1 (GLP-1), a receptorului factorului de necroză tumorală 2 (TNFR1) și a receptorului factorului de necroză tumorală 2 (TNFR2) a fost evaluată prin fluorimetrie de flux pe un analizor laser automat (Bio-Plex ® 200, Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) utilizând sistemul de testare comercială Bio-Plex Pro Human Diabetes 10-Plex Assay (Bio-Rad, SUA) și Bio-Plex Pro ™ Inflamarea umană Panou 1, 37-Plex (Bio-Rad, SUA).

Verificarea normalității distribuției indicatorilor cantitativi a fost efectuată folosind testul Shapiro-Wilk. Deoarece eșantioanele investigate se potrivesc unei distribuții normale, ipoteza egalității valorilor medii ale eșantionului a fost verificată folosind testele t Student. Pentru a evalua semnificația diferențelor dintre eșantioanele cantitative independente care nu au respectat o lege de distribuție normală, a fost utilizat testul neparametric Kruskal-Wallis. Pentru detectarea diferențelor semnificative statistic între grupuri, s-a efectuat o analiză pereche folosind Mann-Whitney neparametric pentru grupuri independente și a fost utilizat testul Wilcoxon pentru grupuri dependente. Pentru a analiza asocierile dintre nivelurile ADNmt și IMC, am folosit corelația rangului Spearman.

înapoi

Poate că creșterea copiilor ADNmt la pacienți după intervenția chirurgicală RYGB (comparativ cu un grup de control 2) poate fi corelată cu caracteristicile metabolismului hormonal postoperator. Efectele pozitive ale operațiilor bariatrice LSG și RYGB asupra greutății corporale și metabolismului carbohidraților sunt obținute prin schimbarea comportamentului alimentar și producerea anumitor hormoni în tractul gastro-intestinal al pacienților. Astfel, la pacienții după tratament chirurgical, IMC scade, totuși, conform datelor din literatură, restabilirea sensibilității la insulină precede o modificare semnificativă a masei țesutului adipos [18]. Există opinia că hormonii cum ar fi grelina și incretinele sunt implicați în primul rând în acest proces.

Ca urmare a intervenției chirurgicale LSG, fundul stomacului este îndepărtat; include bazinul principal de celule producătoare de grelină [19,20,21]. Modelele animale knock-out ale receptorilor de grelină au arătat o sensibilitate îmbunătățită la insulină, o termogeneză mai mare și o activitate mitocondrială prin activarea căilor de semnalizare a protein kinazei activate de AMP (AMPK) [22]. Am constatat aici că nivelul de grelină plasmatică a scăzut la pacienții cu T2DM după LSG comparativ cu condițiile pre-operaționale (p Figura 1). Rezultatele pot indica efectul grelinei asupra normalizării metabolismului glucidic după intervenția chirurgicală bariatrică. Mai mult, nivelul de grelină plasmatică s-a corelat negativ cu numărul de copii ADNmt la toți pacienții observați cu T2DM înainte și după intervenția chirurgicală bariatrică (r = -0,36, p Figura 1). Aceleași rezultate au fost observate și în țesutul muscular al pacienților în stadiile incipiente ale bolii critice [23]. Efectul stimulator al grelinei asupra activității mitocondriilor în neuroni a fost demonstrat anterior [24]. Conform corelației pozitive a nivelului de grelină plasmatică cu nivelul de glucoză și IMC în diferite condiții ale pacientului, putem presupune o legătură funcțională între copiile ADNmt și scăderea nivelului de grelină după intervenția chirurgicală bariatrică. În viitor este necesară o analiză mai aprofundată.

Secreția GIP și GLP-1 crește după RYGB și rezultatul efectului acestora asupra insulinei poate fi principalul motiv pentru scăderea nivelului de glucoză [25,26]. În ciuda nivelului crescut al GIP și al niciunei modificări a nivelului GLP-1 în plasmă după RYGB în comparație cu starea preoperatorie din studiul nostru, nu am reușit să găsim nicio corelație cu numărul de copii ale ADNmt al pacienților. Acest lucru sugerează lipsa relației dintre numărul de copii ADNmt și incretine în cercetarea noastră.

Există dovezi că pacienții obezi cu T2DM suferă de inflamație subclinică cronică a țesutului adipos [27]. Mai mult, există legătura dintre IMC și nivelul citokinelor proinflamatorii caracteristic în principal la pacienții cu T2DM [28,29]. În lucrările noastre anterioare, am arătat corelația dintre numărul de copii ADNmt și factorii proinflamatori (TNF-α) la astfel de pacienți [30]. În concordanță cu aceasta, facem ipoteza că numărul crescut de copii ADNmt în stratul tampon de sânge periferic ar putea fi asociat cu factori proinflamatori care circulă în sângele pacienților după operație.

Numărul de copii ale ADNmt în celulele sanguine la toți pacienții în funcție de sex. Notă: (A) Variația specifică genului în nivelul ADN mt între controale și la pacienți înainte și după ambele operații bariatrice, indiferent de tipul operațiilor. Cutiile albastre corespund bărbaților, cele roz - femei; (B) Dinamica modificărilor nivelului IMC și ADNmt (numărul de copii) este descrisă pentru fiecare pacient cu o săgeată: începutul fiecărei săgeți corespunde condițiilor dinaintea operației și sfârșitul fiecărei săgeți - condiții după operație: albastru— bărbați, roz - femei, săgeți - carcase, puncte - comenzi.

Pentru a investiga mai profund asocierile dintre ADNmt și obezitate, am analizat dinamica nivelului ADNmt pentru fiecare pacient în contextul modificărilor corespunzătoare ale IMC (Figura 2 B: săgețile indică modificările IMC și copiilor ADNmt înainte și după ambele operații bariatrice, indiferent de tipul operațiunilor). Așa cum era de așteptat, am observat scăderi ale IMC la toți pacienții: absolut toate săgețile sunt îndreptate în jos, ceea ce înseamnă că IMC după operație este mai mic decât IMC înainte de operație. Putem observa, de asemenea, că femelele demonstrează o creștere a numărului de copii ADNmt după ambele operații bariatrice (săgeți roz, p Figura 2 B) am putea observa că modificările pronunțate ale IMC sunt asociate cu modificări pronunțate ale copiilor ADNmt (săgețile lungi sunt mai puține abrupte în comparație cu cele scurte): înseamnă că micile modificări ale IMC nu sunt asociate cu creșterea ADNmt, în timp ce modificările mari ale IMC sunt asociate cu creșterea nivelului de ADNmt. Pentru a demonstra statistic această observație, am corelat modificările proporționale ale IMC (contrastul IMC pentru fiecare pacient a fost definit ca IMC după operație minus IMC înainte de operație normalizat de IMC înainte de intervenție) cu modificările proporționale corespunzătoare ale ADNmt în ADNmt pentru fiecare pacient a fost definit ca nivelul mtDNA după operație minus nivelul mtDNA înainte de operație, normalizat de nivelul mtDNA înainte de operație). Am observat o corelație negativă marginal semnificativă între aceste contraste (p = 0,041; rho = -0,312, corelație unilaterală a rangului Spearman), ceea ce înseamnă că cu cât modificările IMC sunt mai mari, cu atât sunt mai mari modificările corespunzătoare ale numărului de copii mtDNA. Această corelație a contrastelor poate vota către o relație funcțională, cauzală, între IMC și copii mtDNA.

4. Concluzii

Rezultatele noastre oferă dovezi de pionierat pentru legătura dintre modificările copiilor de ADNmt în celulele stratului tampon de sânge periferic și anumiți parametri ai metabolismului carbohidraților (nivelul glucozei și HbA1c) în timpul modificărilor IMC ale pacientului la un an după intervenția chirurgicală bariatrică RYGB și LSG. Scăderea copiilor ADNmt poate fi cauza de bază care precede dezvoltarea diabetului de tip 2, ceea ce este în concordanță cu studiile noastre anterioare [30] și lucrările altor autori care demonstrează scăderea copiilor ADNmt la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 și restabilirea funcției mitocondriale. și copii ADNmt după pierderea în greutate [36,37]. Numărul copiei ADNmt este o măsură a funcției mitocondriale și reflectă deteriorarea celulelor induse de oxidant [38]; poate fi utilizat și pentru diagnosticarea anomaliilor metabolice la pacienți. O altă observație care va fi interesantă de înțeles în viitor este motivul pentru care nu observăm efectul de restaurare a ADNmt la bărbați. Acest lucru s-ar putea datora dimensiunii eșantionului nostru relativ limitat și nivelului inițial scăzut de mtDNA la bărbați (chiar și la controale), ceea ce face ca orice modificare să fie mai puțin pronunțată sau datorită unei reglări mai puțin optime a nivelului de mtDNA la bărbați din cauza selecției relaxate a proprietăților mtDNA în bărbați [39].

Materiale suplimentare

Următoarele sunt disponibile online la https://www.mdpi.com/2073-4409/8/5/430/s1, tabelul S1. Nivelul hormonilor de incretină și grelină la pacienți după operații bariatrice LSG și RYGB, [Me (Q1 - Q3)]; Tabelul S2. Nivelul receptorilor TNF superfamiliali la pacienți după operații bariatrice LSG și RYGB, [Me (Q1 - Q3)].

Contribuțiile autorului

Conceptualizare, I.M. și L.L; chirurgie, PZ; Achiziționarea datelor, analiza și interpretarea datelor, D.S., M.V. și K.P., scriere - recenzie și editare, D.S., K.P. și I.M.

Finanțarea

Cercetarea a fost susținută de Russian Science Foundation [Nr. 17-75-20015 la I.M. (abordare ddPCR)], de către Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază [Nr. 18-015-00084-a către L.L. (recrutarea și clasificarea pacienților), nr. 18-29-13055 la K.P. (suport statistic al studiului)], de către Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază și KLG [Nr.19-415-393004-r_mol_a to Д.С. (biochimie a sângelui), nr.19-44-390005-r_a la D.S. (fluorimetrie de curgere)].

Conflicte de interes

Autorii nu declară niciun conflict de interese.