Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

șobolani

Medicina Interna si

Medicina Interna si

Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

Medicina Interna si

Medicina Interna si

Radiologie, Universitatea din Iowa Colegiul de Medicină, Iowa City, Iowa 52242

Departamentul Serviciului de Cercetare a Afacerilor Veteranilor și Departamentele

Medicina Interna si

Medicina Interna si

Abstract

Hiperreactivitatea bronșică prelungită (BHR) este o consecință prelungită a infecției acute a tractului respirator. Este deosebit de important la persoanele cu astm, dar este evident și la persoanele fără astm (49). BHR poate urmări infecția căilor respiratorii inferioare (bronșiolită respiratorie indusă de virusul sincițial) sau rinita și faringita care sunt produse de rinovirus. Ipotezăm că VAD ar putea contribui la excesul de morbiditate și mortalitate prin infecții ale tractului respirator prin creșterea sau prelungirea BHR. Pentru a începe abordarea acestei ipoteze, am studiat șobolanii cu VAD, în absența infecției respiratorii, pentru a determina dacă VAD în sine este asociat cu BHR.

Alții au demonstrat că o scădere a funcției receptorului muscarinic contribuie la BHR în timpul răspunsului la un antigen sensibilizant sau după infecția respiratorie virală (1). Receptorul muscarinic M2 (M2R) este un important regulator al rezistenței căilor respiratorii și funcția sa este modificată de o varietate de afecțiuni inflamatorii. M2R acționează ca autoreceptoare și suprimă semnalizarea muscarinică după contracția colinergică a mușchiului neted al căilor respiratorii prin diminuarea eliberării de acetilcolină din veziculele prejunctionale din mușchiul neted (9). Aceasta limitează disponibilitatea acetilcolinei, care poate stimula receptorii M3 muscarinici postjunctionați (M3R) pe celulele musculare netede bronșice și induce contracția musculaturii netede a căilor respiratorii. Funcția M2R este diminuată în astm, ceea ce duce la o scădere a calibrului bazei căilor respiratorii și hiperreactivitate la bronhoconstrictoare (14).

Următoarele studii demonstrează că șobolanii cu VAD sunt mai receptivi la metacolină, un agonist muscarinic, decât șobolanii care au fost menținuți pe o dietă suficientă cu vitamina A (VAS). În conformitate cu această constatare, șobolanii cu VAD demonstrează o scădere a proteinei M2R bronșice și a funcției.

Pregătirea șobolanilor VAD.

Analiza BHR.

Distanță de 99m Tc-DTPA din spațiul aerian.

Analize histologice ale grosimii peretelui căilor respiratorii.

În momentul eutanasiei, plămânul stâng a fost spălat și umflat cu paraformaldehidă 4% în fosfat de sodiu 0,1 M, pH 7,0, timp de 6 ore. Plămânii fixi au fost tăiați sagital lângă hil în secțiuni de 3 mm, deshidratați și încorporați în parafină. Blocurile de parafină au fost secționate la intervale de 3,5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. Secțiunile au fost inițial fotografiate folosind un microscop Olympus BX40 și diapozitive de 35 mm au fost pregătite și scanate folosind un scaner Nikon. Imaginile digitalizate au fost analizate folosind programul Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Bronhiile care au prezentat un cerc închis sau un profil oval au fost selectate pentru a cuantifica grosimea peretelui bronșic (2). Perimetrele definite de membrana bazală subepitelială și marginea periferică a peretelui exterior al adventiției au fost urmărite electronic. Aria peretelui bronșic total a fost calculată ca diferență între aria definită de perimetrul adventitial și aria definită de perimetrul luminal (33). Acest instrument analitic corectează variabilitatea grosimii peretelui într-o anumită secțiune. Zona peretelui a fost împărțită de circumferința membranei bazale subepiteliale pentru a se normaliza pentru variația dimensiunilor căilor respiratorii (6).

Evaluarea fiziologică a funcției M2R.

Imunoblotare pentru M2R și M3R.

Pentru a demonstra că anticorpii au fost specifici pentru țintele proteice preconizate, s-au folosit peptide blocante. Aceștia au fost incubați cu anticorpii lor respectivi înainte ca anticorpul să fie adăugat la proteinele bronșice imobilizate. Peptidele au fost unice pentru M2R sau M3R și au fost peptide imunizante care au fost utilizate pentru a produce anticorpii anti-M2R și, respectiv, anti-M3R. Condițiile pentru SDS-PAGE și imunoblotarea au fost identice cu cele descrise mai sus.

Analize statistice.

Valorile sunt medii ± SE. Penh la fiecare concentrație de metacolină sau modificarea rezistenței căilor respiratorii la fiecare doză de pilocarpină a fost comparată la șobolanii VAS și VAD utilizând o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA). Abundența proteinelor M2R și M3R în țesutul bronșic sau a retinoizilor din plasmă și a ficatului șobolanilor VAS și VAD a fost comparată folosind studiile lui Studentt-test pentru variabile nepereche. Diferențele au fost considerate semnificative atunci când P

Tabelul 1. Retinoizi din plasmă și ficat de la șobolani Lewis

Valorile sunt media ± SE a numărului de șobolani între paranteze. VAD, deficit de vitamina A; TU, vitamina A suficientă.

BHR la animalele neanesteziate.

Evaluarea BHR la animalele neanesteziate ne permite să evaluăm răspunsul la metacolină la șobolani care ar putea fi, de asemenea, utilizat pentru studii privind clearance-ul 99m Tc-DTPA. Penh a fost folosit de alții pentru a evalua obstrucția căilor respiratorii și este un instrument precis și util pentru a evalua modificările seriale ale funcției căilor respiratorii în timpul unui protocol de provocare bronșică la animalele mici (11, 12,35). Datele noastre indică faptul că acest parametru crește după administrarea metacolinei într-un mod dependent de concentrație. Rezultatele studiilor folosind șobolani Sprague-Dawley (Fig.1) și Lewis (Fig.2) sunt prezentate și în ambele cazuri demonstrează că Penh crește într-o măsură mai mare la o concentrație mai mică de metacolină în VAD decât la șobolanii VAS. Diferențele sunt semnificative (ANOVA unidirecțional și testul post hoc Student Newman-Keuls). Rezultatele sunt reprezentative pentru cele trei studii efectuate cu șobolani Sprague-Dawley și trei studii cu șobolani Lewis.

FIG. 1.Experiment reprezentativ (1 din 3) care demonstrează creșterea dependentă de concentrație în pauza îmbunătățită (Penh) produsă de metacolină aerosolizată (MeCh) în vitamina A suficientă (VAS, ●) și deficientă în vitamina A (VAD, ■) Sprague-Dawley șobolani. Valorile sunt mijloace ± SE (n = 3 animale pe grup). *P


FIG. 2.Experiment reprezentativ (1 din 3) care demonstrează creșterea dependentă de concentrație a Penh produsă de metacolină aerosolizată la șobolani Lewis VAS (●) și VAD (■). Valorile sunt mijloace ± SE (n = 4 animale pe grup). *P

Distanță de 99m Tc-DTPA din spațiile aeriene.

FIG. 3.Diagrama reprezentativă a clearance-ului 99m Tc-dietilenetriaminapentaacetic (DTPA) din plămânii unui șobolan VAD Sprague-Dawley. 99m Tc-DTPA a fost instilat în trahee și a fost analizată cantitatea de evenimente de degradare de 99m Tc localizate peste plămâni care s-au acumulat pe un interval de 20 s. Distanțele din zonele plămânilor drept (R, ▾) și stâng (L, plămâni) sunt prezentate separat și ca clearance combinat (L + R, ●) de la ambii plămâni. Liniile reprezintă cea mai bună potrivire și au fost calculate utilizând regresia liniară. Panta liniei pentru L + R este de -7,53 evenimente de descompunere/min.


FIG. 4.Clearance-ul mediu de 99m Tc-DTPA de la ambii plămâni a șobolanilor 6 VAS și 6 VAD Sprague-Dawley care au fost analizați în 2 experimente. Se arată pante ale liniilor. Pante au fost semnificativ diferite (P

Analiza diametrului bronșic la șobolani VAD și VAS.

Deoarece nu au fost observate diferențe legate de vitamina A în clearance-ul DTPA, au fost analizați alți parametri pentru a determina dacă acestea ar putea explica creșterea BHR la șobolanii VAD. Alții au demonstrat că diametrul bronșic este scăzut în timpul afecțiunilor inflamatorii care produc BHR la șobolani și la oameni cu astm (33, 48). Diametrul bronșic a fost analizat folosind tehnici morfometrice și nu a fost modificat semnificativ de VAD. S-a calculat raportul suprafeței peretelui bronșic cu circumferința membranei bazale epiteliale: 3,78 ± 0,16 și 3,61 ± 0,22 (medie ± SE, nesemnificativă, nepereche) t-test) pentru VAS (19 căi respiratorii de la 5 animale) și respectiv VAD (18 căi respiratorii de la 5 animale), respectiv. Astfel, un diametru bronșic bazal scăzut, care contribuie la o rezistență crescută a căilor respiratorii, nu a explicat reacția mai mare la metacolină observată la șobolanii VAD.

Analiza funcției M2R.

FIG. 5.Atenuarea bronhoconstricției mediată vag (raportul dintre creșterea rezistenței căilor respiratorii după stimularea vagală, adică după administrarea pilocarpinei, la creșterea înainte de administrarea pilocarpinei) ca răspuns la diferite concentrații de pilocarpină ([pilocarpină]) în VASn = 4) și VADn = 4) șobolani. Valorile sunt medii ± SE.

Analiza expresiei proteinei M2R.

FIG. 6.A: anticorpii anti-muscarinici de tip 2 (M2R) și anticorpii anti-muscarinici de tip 3 (M3R) sunt capabili să detecteze în mod unic proteinele care conțin peptidele lor imunizante (blocante) unice și preincubează anticorpii în prezență (+) și absență - ) a peptidelor imunizante a împiedicat detectarea proteinelor așteptate. Benzi 1 și3, Șobolani VAD; benzi 2 și 4, Voi șobolani. Razele moleculare ale proteinelor sunt prezentate la dreapta. B: imunobloti reprezentativi pentru proteinele M2R și M3R din țesutul bronșic. C: densitate (medie ± SE, n = 3) de proteină M2R și M3R din imunoblot în A și alți 2 imunobloti similari pentru M2R și M3R. *P

Aceste investigații indică faptul că VAD crește capacitatea de reacție a căilor respiratorii la un stimul colinergic aerosolizat și că această creștere a capacității de reacție implică o modificare a expresiei și funcției M2R. La șobolanii VAD, capacitatea de a dezvolta supresia bronhoconstricției mediată de M2R este diminuată, deoarece există o reducere aproape dublă a proteinei M2R în țesutul bronșic al acestora, comparativ cu șobolanii VAS. Răspunsul crescut al căilor respiratorii a fost observat la șobolanii Sprague-Dawley și Lewis. Hipersensibilitatea căilor respiratorii nu pare să rezulte dintr-o creștere a permeabilității barierei epiteliale la molecule mici sau dintr-o scădere a diametrului căilor respiratorii nestimulate. Aceste descoperiri demonstrează un efect nou al VAD asupra plămânului și sugerează că retinoizii pot fi implicați în reglarea reacției căilor respiratorii.

Alții au investigat efectele VAD la șoareci și suplimentarea cu vitamina A a șobolanilor asupra inflamației căilor respiratorii induse de ozon și BHR (21, 34). La șoareci și șobolani, vitamina A a avut un efect salutar asupra influxului de neutrofile induse de ozon. Cu toate acestea, suplimentarea cu vitamina A nu a modificat reacția bronșică la acetilcolină la șobolani (21). Similar studiului lui Paquette și colab. (34), nu am observat că VAD de la sine a crescut celulele inflamatorii în căile respiratorii sau în plămânul distal (datele nu sunt prezentate). Deși am observat că VAD crește BHR, Hisada și colab. (21) au constatat că suplimentarea cu vitamina A nu ameliorează creșterea BHR indusă de ozon. Suplimentarea cu vitamina A nu poate modifica disponibilitatea vitaminei A la animalele cu depozite de ficat pline (majoritatea dietelor comerciale conțin retinol în cantități mai mari decât necesarul zilnic) și, prin urmare, probabil că nu ar modifica disponibilitatea retinolului în căile respiratorii. Cu toate acestea, într-un model de deficiență, în care depozitele hepatice și nivelurile plasmatice de retinol sunt reduse, depozitele căilor respiratorii sunt, de asemenea, reduse (27). Astfel, este mai probabil să observăm o modificare a reactivității bronșice într-un model de deficiență decât într-un model de suplimentare.

Hipersensibilitatea căilor respiratorii la stimulii colinergici a fost studiată într-o varietate de modele animale și este influențată de mai multe afecțiuni relevante pentru oamenii cu astm. Modele de hipersensibilitate a căilor respiratorii la antigenele sensibilizante, cum ar fi ovalbumina, au arătat că proteina bazică majoră eozinofilă poate antagoniza legarea acetilcolinei de M2R și că acest lucru are ca rezultat o scădere a funcției inhibitoare a receptorului (13). Alții au arătat că infecția virală parainfluenza-1 a șobolanilor duce la o creștere a hiperreaptivității căilor respiratorii care persistă până la 2 săptămâni după infecție (46). Virusul Parainfluenza-1 crește, de asemenea, BHR la cobai în timpul fazei acute a infecției (1). O scădere a funcției inhibitoare a M2R este responsabilă de hiperreactivitatea căilor respiratorii la ambele modele. Aceste și alte observații au stabilit în mod clar că M2R joacă un rol dominant în reglarea concentrației de acetilcolină care este prezentată M3R pe mușchiul neted al căilor respiratorii. Nu există dovezi că numărul sau funcția M3R este modificată în aceste modele. Astfel, furnizarea de acetilcolină către celula musculară netedă, mai degrabă decât receptivitatea receptorului, pare a fi factorul determinant.

Mulțumim lui J. Snyder (Departamentul de Anatomie, Universitatea din Iowa) pentru că a pus la dispoziție programul Image-Pro Plus.

NOTĂ DE PICIOASĂ

Aceste investigații au fost susținute de Departamentul pentru Cercetarea Afacerilor Veteranilor (SE McGowan și UC Kopp), Granturile Institutului Național de Inimă, Plămân și Sânge HL-53430 (SE McGowan) și HL-59324 (JN Kline), Institutele Naționale de Sănătate O ' Grantul subvenției Centrului pentru bolile renale Brien DK-52617 și Grant-in-Aid Asociația Americană a Inimii 0150024N.

Adresa pentru cereri de retipărire și alte corespondențe: S. E. McGowan, C33B GH, Dept. of Internal Medicine, Universitatea din Iowa Spitale și clinici, 200 Hawkins Dr., Iowa City, IA 52242 (E-mail: [email protected] edu).

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Publicat pentru prima dată pe 7 decembrie 2001; 10.1152/ajplung.00319.2001