Affiliation Bone and Joint Research Group, Human Development and Health, Institute of Developmental Sciences, Faculty of Medicine, University of Southampton, Southampton, Marea Britanie

maternă

Afiliere Grupul de cercetare maternă, sarcină și copil, Dezvoltare umană și sănătate, Institutul de Științe ale Dezvoltării, Facultatea de Medicină, Universitatea din Southampton, Southampton, Regatul Unit

Affiliation Bone and Joint Research Group, Human Development and Health, Institute of Developmental Sciences, Faculty of Medicine, University of Southampton, Southampton, Marea Britanie

  • Stuart Lanham,
  • Felino R. Cagampang,
  • Richard O. C. Oreffo

Cifre

Abstract

Studiile sugerează creșterea și dezvoltarea osoasă și susceptibilitatea la boli vasculare în viața ulterioară sunt influențate de nutriția maternă, în timpul vieții intrauterine și postnatale timpurii. Există dovezi ale rolului proteinelor dependente de vitamina K (VKDP), inclusiv Osteocalcina, proteina Matrix-gla, Periostin și Gas6, în dezvoltarea osoasă și vasculară. Acest studiu extinde analiza VKDP efectuate anterior la descendenți în vârstă de 6 săptămâni, la descendenți cu vârsta de 30 de săptămâni, pentru a evalua efectele pe termen lung ale unei diete materne și postnatale cu conținut ridicat de grăsimi (HF) asupra expresiei VKDP. În general, o dietă maternă cu IC și dieta descendenților au exacerbat modificările osoase observate. S-au observat diferențe specifice sexului și ale țesuturilor în expresia VKDP atât pentru aorta, cât și pentru țesuturile femurale. În plus, s-au observat corelații semnificative între nivelurile de expresie femurală OCN, Periostin Gas6 și Vkor și măsurile structurii osoase femurale. Mai mult, nivelurile de exprimare MGP, OCN, Ggcx și Vkor corelate cu masa și volumul de grăsime, la ambele sexe. În rezumat, studiul actual a evidențiat importanța efectelor pe termen lung ale nutriției materne asupra dezvoltării osoase a descendenților și corelația VKDP cu structura osoasă.

Citare: Lanham S, Cagampang FR, Oreffo ROC (2015) Dieta maternă bogată în grăsimi afectează nivelurile de exprimare a proteinelor dependente de vitamina K ale descendenților. PLoS ONE 10 (9): e0138730. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138730

Editor: Claudia Miele, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ITALIA

Primit: 3 iulie 2015; Admis: 2 septembrie 2015; Publicat: 18 septembrie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Rosetrees Trust, numărul grantului M425 (http://www.rosetreestrust.co.uk) SL finanțat. Consiliul de cercetare a biotehnologiei și științelor biologice, numărul de grant BB/G01812X/1 (http://www.bbsrc.ac.uk) finanțat FC. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Proteinele dependente de vitamina K (VKDP) constau din cel puțin 16 proteine ​​cunoscute cu roluri variate, inclusiv factori implicați în coagularea sângelui (cum ar fi factorii VII și X) și anti-coagulare (de exemplu, proteinele C și S). Cu toate acestea, alte VKDP au roluri emergente în alte organe, în timp ce patru VKDP au fost raportate că joacă roluri cheie atât în ​​țesuturile osoase, cât și în cele vasculare, cu modificări ale expresiei care au ca rezultat patologii ale bolii [1].

Există acum dovezi că osul poate acționa ca un organ endocrin, influențând alte organe, osteocalcina (OCN) fiind implicată ca un jucător cheie în acest proces [2-4]. OCN este un hormon secretat de osteoblaste care crește sensibilitatea și producția la insulină, sporind astfel utilizarea glucozei și cheltuielile de energie [5].

Proteina gla matrice (MGP) este legată în mod evolutiv de OCN [6], astfel poate avea proprietăți hormonale. Cu toate acestea, MGP se găsește în tot corpul și previne calcificarea țesuturilor precum plămânul, rinichii, arterele coronare și aorta [7]. Periostina VKDP este importantă în creșterea osoasă [8] și esențială pentru dezvoltarea cardiacă [9]. Periostina este prezentă în țesuturile conjunctive supuse forțelor mecanice (de exemplu, valvele cardiace) și este prezentă în glomeruli la pacienții cu nefropatie [10]. Periostina este, de asemenea, extrem de bine reglată după leziuni ale țesutului cardiac [8].

În cele din urmă, proteina specifică 6 pentru stoparea creșterii (Gas6) reglează un amestec de procese, inclusiv supraviețuirea și proliferarea celulelor, aderența și migrarea celulelor, stabilizarea cheagurilor de sânge și eliberarea citokinelor inflamatorii. Recent, s-a demonstrat că expresia Gas6 reglează diferențierea condrogenă [11] și că este asociată cu toleranță modificată la glucoză, inflamație [12], mică pentru vârsta gestațională [13], precum și a bolilor cardiovasculare [14]. În plus față de aceste VKDP, s-a dovedit că vitamina K în sine este esențială în coagulare, precum și că joacă un număr de roluri în creșterea și dezvoltarea osoasă [15]. Un studiu recent la pacienții cu dializă sugerează deficiența vitaminei K ca posibilă cauză atât a fracturilor vertebrale, cât și a calcificării vasculare [16].

În plus, sunt necesare cel puțin două enzime pentru funcția VKDP; i) gamma-glutamil carboxilaza (Ggcx), care mediază carboxilarea dependentă de vitamina K a reziduurilor de glutamat în reziduuri gamma-carboxiglutamat (Gla) care leagă calciu, transformând astfel hidrochinona vitaminei K în epoxid și, ii) epoxid reductază de vitamina K (Vkor ), care reduce epoxidul de vitamina K inactiv la vitamina K hidroquinonă activă prin intermediul vitaminei K [17].

Studiile epidemiologice și pe animale indică faptul că factorii de mediu, cum ar fi nutriția maternă, influențează riscul bolii în viața ulterioară [18-21]. Într-adevăr, numeroase studii au arătat că restricția de creștere intrauterină, o măsură proxy a mediului prenatal slab, poate afecta controlul cardiovascular și metabolic la animale și oameni într-un mediu postnatal abundent din punct de vedere nutrițional [22-25]. În plus, disfuncția sistemului vascular poate duce la o serie de boli, inclusiv hipertensiune arterială, aterogeneză, diabet de tip 2, boli coronariene, sindrom metabolic și obezitate. În mod critic, riscul și dezvoltarea acestor boli s-au dovedit a fi influențate de nutriția maternă în timpul sarcinii; denumit în mod obișnuit conceptul originilor dezvoltării [20]. Se consideră că mecanismele de bază implică modificări epigenetice, rezultând modificări pe tot parcursul vieții în expresia genelor [26].

Anterior, am evaluat efectul dietei materne și descendente cu conținut ridicat de grăsimi asupra proteinelor VKD din aorta și osul de la șoareci de 6 săptămâni [27]. Datele prezentate în acest studiu extind aceste studii cu analize efectuate la descendenți la vârsta de 30 de săptămâni.

Materiale și metode

Proiectare experimentală și îngrijire a animalelor

Toți șoarecii au fost crescuți în cadrul Facilității de cercetare biomedicală a Universității din Southampton și au fost adăpostiți în medii adecvate în camere menținute la 22 ± 2 ° C cu o lumină de 12 h: 12 h ciclu de întuneric.

Declarație etică

Toate procedurile pentru animale au fost în conformitate cu reglementările din Regatul Unit privind animalele (procedurile științifice) Act 1986 și au fost efectuate sub licența proiectului Home Office numărul 30–2968. Studiul a primit aprobarea instituțională de la Universitatea din Southampton, Comitetul de etică pentru cercetarea facilității de cercetare biomedicală.

Dieta bogată în grăsimi

La vârsta de 10 săptămâni, 11 șoareci femele de tulpină C57BL/6 au fost împerecheați cu bărbați C57BL/6 cu vârste potrivite. Femelele au fost împerecheate cu bărbați separați și după confirmarea împerecherii (prezența unui dop vaginal) au fost adăpostite individual și hrănite fie cu o dietă standard de control chow (C, n = 5 baraje) RM-1 (Special Diet Services, Witham, Essex, Marea Britanie) sau o dietă bogată în grăsimi (HF, n = 6 baraje) (dieta specială pentru servicii dietetice 824053, servicii speciale pentru dietă). Am folosit aceste diete într-un studiu anterior [27]. Aceste diete C sau HF au fost continuate pe tot parcursul sarcinii și alăptării până când descendenții au fost înțărcați la vârsta de 3 săptămâni. Descendenții înțărcați au fost apoi subdivizați în continuare pentru a oferi fiecărui grup alimentar parental descendenți care au fost hrăniți fie cu control (grupuri C/C sau HF/C), fie cu o dietă bogată în grăsimi (grupuri C/HF sau HF/HF). Coechipierii de același sex de pe aceeași dietă post-înțărcare au fost găzduiți împreună. Pentru toate grupurile n = 10-12 animale, cu n = 5-7 masculi sau femele pe grup. Această dietă a fost continuată încă 27 de săptămâni până la momentul prelevării probelor la vârsta de 30 de săptămâni. Animalele au fost ucise prin dislocarea colului uterin.

Tomografie computerizată 3D

Animalele întregi au fost scanate folosind un scaner Skyscan 1176 in vivo micro-CT (Bruker microCT, Kontich, Belgia). Toate scanările au fost efectuate la 50 kV, 500 μA cu filtru de aluminiu de 0,5 mm, cu o etapă de rotație de 0,5 °. Imaginile secțiunii transversale individuale 2D au fost reconstruite folosind software-ul Bruker NRecon versiunea 1.6.5.8. Rezoluția Voxel a fost de 18 μm. Imaginile reconstituite au fost analizate folosind software-ul Bruker CTAn versiunea 1.13.5.1 cu praguri adecvate pentru a determina volumele de grăsime, țesut moale și os. Pentru vertebră, a fost analizat corpul vertebral al L3. Pentru femur, a fost analizată o secțiune de 0,35 mm în înălțime și 1,8 mm în spatele plăcii de creștere la capătul distal.

Parametrii trabeculari măsurați au fost BvTv (volumul osului într-un volum total măsurat), BsBv (raportul suprafață la volum al osului trabecular), grosimea trabeculară, distanța trabeculară (distanța dintre trabecule), indicele modelului structural (SMI, măsura convexității suprafeței unde un SMI mai mic este indicativ pentru mai multe trabecule conectate, asemănătoare plăcilor), factor de model trabecular (indicator al conectivității trabeculelor unde valori mai apropiate de zero, atât pozitive, cât și negative, reprezintă o structură mai conectată).

Colectie de mostre

În urma scanării CT (vezi mai sus), aorta toracică și femurul stâng au fost îndepărtate. Femurul stâng a fost curățat de țesuturi moi, tăiat în jumătate, iar măduva a fost spălată folosind PBS printr-un ac de manometru fin. Jumătățile au fost apoi tăiate în bucăți mai mici. După prelucrare, piesele osului de aortă și femur au fost plasate imediat în reactivul Trizol (Invitrogen).

Extracția ARN și producția de ADNc

ARN-ul a fost extras din probe în reactivul Trizol (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația și puritatea ARN au fost determinate de densitățile optice la 230 nm, 260 nm și 280 nm folosind un NanoDrop Spectrophotometer (Labtech, Uckfield, Marea Britanie) și ADNc produs din ARN 500ng folosind kitul de sinteză Superscript VILO cDNA (Invitrogen) urmând instrucțiunile producătorului.

PCR cantitativă

Cuantificarea relativă a expresiei genelor a fost efectuată cu un sistem de detectare ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Warrington, Marea Britanie). S-a preparat amestecul de reacție de 20 pl, conținând 1 pl de ADN complementar, 10 pl de Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) și 250 nM din fiecare primer. Condițiile de ciclare termică au constat dintr-o etapă inițială de activare la 95 ° C timp de 10 minute, urmată de un program PCR în 2 etape de 95 ° C timp de 15 secunde și 60 ° C timp de 60 secunde timp de 40 de cicluri. A fost obținută o curbă de disociere pentru fiecare cursă. Metoda 2-Ct a fost utilizată pentru cuantificarea relativă a expresiei genei în comparație cu grupul masculin C/C, iar datele au fost normalizate la expresia gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (Gapdh) (care a fost neschimbată între grupuri). Primerii de șoareci utilizați pentru qPCR au fost: Gapdh forward, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; invers, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; Mgp forward, TCAACAGGAGAAATGCCAACAC; invers, CGGTTGTAGGCAGCGTTGT; OCN înainte, CTGACCTCACAGATGCCAAGC; invers, TGGTCTGATAGCTCGTCACAAG; Gas6 înainte, TGCTGGCTTCCGAGTCTTC; invers, CGGGGTCGTTCTCGAACAC; Periostina înainte, CCTGCCCTTATATGCTCTGCT; invers, AAACATGGTCAATAGGCATCACT; Ggcx forward, GTTGCTCCCGCCTCAGATAAA; invers, TAAGCAGGGTCACGACACTCT; Vkor forward, GCTGGCTTAGCCCTCTCAC; invers, CTGTCCGCTCCTAGCATGT .

Statistici

S-a observat că toate datele pentru toate grupurile de dietă au fost distribuite în mod normal utilizând testul Shapiro-Wilks. Efectul dietei materne, al descendenților și al sexului a fost determinat de un ANOVA cu trei căi, urmat de testul post hoc Bonferroni utilizând versiunea PASW 21 (SPSS UK, Woking, Surrey, Marea Britanie). Datele sunt prezentate ca medie ± Deviație standard, cu excepția cazului în care se arată altfel; semnificația a fost determinată cu un nivel p de 0,05 sau mai mic. Au fost utilizate cel puțin 4 baraje pentru fiecare grup de dietă. Relațiile dintre variabile au fost testate folosind analiza de regresie liniară (univariantă și multivariantă) unde a p Fig 1. Masa descendenților și compoziția corpului la treizeci de săptămâni de vârstă.

Graficele arată (A). Masa. (B). Volumul de grăsimi, țesuturi și oase. (C). Procentul de grăsime corporală, țesut și os. În cadrul fiecărui sex și pentru fiecare tip de țesut, barele cu litere diferite sunt semnificativ diferite (p. Tabelul 1. Analiza de regresie liniară între nivelurile de exprimare a proteinelor femurale dependente de vitamina K și compoziția corpului.

Femei descendenți.

Pentru descendenții de sex feminin, o dietă HF a descendenților, fie singură, fie în combinație cu o dietă HF maternă, a crescut masa descendenților peste nivelurile de control (C/HF sau HF/HF, ambele p Fig 2. Structura osului femural la treizeci de săptămâni de vârstă.

Pentru grupul dietetic și sex, rezultatele sunt prezentate pentru (A). Lungimea femurului. (B). Volumul osului femural. (C). Grosimea peretelui intermediar. (D). Diametrul axului mediu. (E). Densitatea osoasă a femurului masculin. (F). Densitatea osoasă a femurului feminin. Pentru graficele de densitate, intervalul de densitate osoasă 80-140 reprezintă osul trabecular, iar 140-220 reprezintă osul cortical. Pentru toate grupurile, n = 5-7 pe grup. Graficele arată media plus limitele de încredere de 95%.

Femei descendenți.

Pentru grupul dietetic și sex, rezultatele sunt prezentate pentru (A). Volumul osos al corpului vertebral. (B). Lungimea corpului vertebral. (C). Raportul suprafeței osoase la volum. (D). Grosimea trabeculară. (E). Distanța trabeculară. (F). Densitatea osoasă a vertebrei întregi masculine. (G). Densitatea osoasă a vertebrei întregi feminine. Pentru graficele de densitate, intervalul de densitate osoasă 80-140 reprezintă osul trabecular, iar 140-220 reprezintă osul cortical. Pentru toate grupurile, n = 5-7 pe grup. Graficele arată media plus limitele de încredere de 95%.

Femei descendenți.

Pentru descendenții de sex feminin, nu s-au observat diferențe semnificative față de controalele C/C în oricare dintre celelalte grupuri de descendenți din volumul osului vertebral (Fig 3A panoul drept), lungimea corpului vertebral (Fig 3B panoul drept) sau distanța trabeculară (Fig 3E dreapta panou). Cu toate acestea, a existat o reducere a raportului suprafeței osoase trabeculare la volum în toate grupurile de descendenți comparativ cu controalele C/C (Fig. 3C panoul din dreapta), cea mai mare reducere apărând în grupul C/HF. A existat o creștere semnificativă corespunzătoare a grosimii trabeculare în ambele grupuri de descendenți pe dieta HF postnatală comparativ cu controalele C/C (Fig. Panoul din dreapta 3D), cea mai mare grosime apărând în grupul C/HF. Comparativ cu controalele C/C, descendenții C/HF au arătat, de asemenea, un volum crescut al osului trabecular la raportul volumului total (Tabelul 2) și un factor de tip trabecular redus. Pentru densitatea osoasă, grupurile de descendenți din barajele alimentate cu HF (HF/C și HF/HF) au prezentat o suprafață osoasă semnificativ mai mare, comparativ cu grupurile de descendenți din barajele alimentate cu C (C/C și C/HF), pentru intervalul 80-120 (p Fig. 4. Niveluri medii relative de expresie genetică în Aorta pentru șoareci vechi de 30 de săptămâni.

Expresia genică a fost determinată prin qPCR. Graficele arată expresia genei pentru (A). Pop, (B). Periostin, (C). Gaz6, (D). Ggcx și (E). Vkor. Expresia genică este prezentată în raport cu grupul C/C masculin. Pentru toate grupurile, n = 5-7 pe grup. Graficele arată media plus limitele de încredere de 95%.

Femei descendenți.

Nivelurile de expresie ale Mgp, Periostin, Gas6, Ggcx și Vkor în aortă sunt prezentate în Fig 4 (panourile din dreapta). Nivelurile de expresie MGP au fost semnificativ mai mari la descendenții feminini HF/C comparativ cu martorii C/C (p = 0,007, Fig 4A panoul din dreapta). Nu s-au observat diferențe semnificative în nivelurile de expresie ale Periostin, Gas6 sau Vkor. Nivelurile de expresie Ggcx au fost semnificativ mai mari la descendenții HF/HF comparativ cu toate celelalte grupuri (p = 0,01 pentru controale, p = 0,002 pentru HF/C și C/HF, Fig 4D panoul din dreapta).

VKDP și os femural

Descendenți masculi.

Nivelurile de expresie ale ARNm ale Mgp, OCN, Periostin, Gas6, Ggcx și Vkor în femur sunt prezentate în Fig 5 (panourile din stânga). Nivelurile de expresie MGP au fost semnificativ mai mari în grupul HF/HF comparativ cu descendenții HF/C (p = 0,01) și C/HF (p = 0,04), deși nu la controale (Fig 5A panoul din stânga). Nivelurile de OCN au fost semnificativ mai mari la descendenții masculi HF/HF comparativ cu grupurile HF/C și C/HF (ambele p Fig 5. Niveluri medii de expresie genetică relativă la femur pentru șoareci vechi de 30 de săptămâni.

Expresia genică a fost determinată prin qPCR. Graficele arată expresia genei pentru (A). Pop, (B). Osteocalcina, (C). Periostin, (D). Gaz6, (E). Ggcx și (F). Vkor. Expresia genică este prezentată în raport cu grupul C/C masculin. Pentru toate grupurile, n = 5-7 pe grup. Graficele arată media plus limitele de încredere de 95%.

Femei descendenți.

Nivelurile de expresie MGP au fost semnificativ mai mari la descendenții feminini HF/HF comparativ cu grupurile de control C/C (p = 0,02) și HF/C (p = 0,002) (Fig 5A panoul din dreapta). Nivelurile de OCN la descendenții feminini au fost semnificativ mai mari decât martorii din grupul de dietă HF/HF (p = 0,02, Fig. 5B panoul din dreapta). Nivelurile de expresie ale periostinei au fost semnificativ mai mici în descendenții C/HF comparativ cu toate celelalte grupuri de dietă (p = 0,002 pentru martori, p = 0,03 pentru HF/C și p = 0,002 pentru HF/HF, Fig. 5C panoul din dreapta). Nu s-au observat diferențe la nivelurile de expresie Gas6. Nivelurile de expresie ale Ggcx au fost semnificativ crescute în grupul HF/HF comparativ cu celelalte trei grupuri de dietă (toate p Tabelul 3. Analiza regresiei liniare între nivelurile de exprimare a proteinelor femurale dependente de vitamina K și factorii structurali ai femurului sau a 3-a vertebră lombară.

Femei descendenți.