School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Campus Sutton Bonington, Loughborough, Marea Britanie; și

paternă

Aston Research Center for Healthy Aging, School of Life and Health Sciences, Universitatea Aston, Birmingham, Marea Britanie

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: A. J. Watkins, Centrul de Cercetare Aston pentru Îmbătrânirea Sănătoasă, Școala de Științe ale Vieții și Sănătății, Universitatea Aston, Birmingham. B4 7ET, UK (e-mail: [email protected]).

School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Campus Sutton Bonington, Loughborough, Marea Britanie; și

Abstract

Deși înțelegerea noastră asupra consecințelor dezvoltării manipulării mediului matern este bine definită, impactul fiziologiei paterne și al stării nutriționale în jurul concepției rămâne în mare parte subinvestigat. Studiile efectuate pe oameni și șoareci au demonstrat că creșterea indicelui de masă corporală masculin (IMC) se asociază cu motilitatea redusă a spermei (19), incidența crescută a anomalii spermatozoizilor (23) și a fragmentării ADN (11) și a reducerii ratelor de sarcină (17). La șoareci, profilele metabolice ale descendenților, incluzând lipidele hepatice și biosinteza colesterolului la înțărcare, glucoza serică, IGF-1 și nivelurile de corticosteron sunt modificate ca răspuns la LPD paternă (9) sau la post prematur (2). Consumul unei diete bogate în grăsimi (27) sau cu conținut ridicat de energie (36) are un impact negativ asupra motilității spermei, integrității ADN și ratelor de dezvoltare a blastocistului și afectează funcția celulelor β pancreatice ale descendenților (28). La bărbați, s-a dovedit că obezitatea paternă se asociază cu dezvoltarea scăzută a blastocistului și rata natalității vii (5) și cu starea de metilare a ADN a IGF2 regiune metilată diferențial în sângele din cordonul ombilical al nou-născuților (42).

Deși aceste studii identifică transmiterea intergenerațională a tulburărilor metabolice la descendenții tineri prin mecanisme mediate de spermă, impactul asupra fenotipului cardiovascular și metabolic al descendenților adulți rămâne necunoscut. Prin urmare, scopul studiului nostru actual a fost de a determina impactul unei LPD paterne asupra markerilor bine definiți ai sănătății cardiovasculare și metabolice a descendenților adulți, concentrându-se pe analiza tensiunii arteriale a descendenților adulți, funcția arterială, toleranța in vivo la glucoză și expresia a genelor reglatoare cardiovasculare și metabolice.

Tratamente pentru animale.

Toți șoarecii și procedurile experimentale au fost efectuate folosind protocoale aprobate de, și în conformitate cu Legea din 1986 a Ministerului de Interne al Regatului Unit (Proceduri științifice) din 1986 și comitetul local de etică de la Universitatea din Nottingham. Șoarecii C57BL/6 de sex masculin virgin (vechi de 9 săptămâni) și femele (vechi de 5-9 săptămâni) (Harlan, Belton, Leicestershire, Marea Britanie) au fost întreținuți timp de 2 săptămâni la Unitatea de Suport Bio a Universității din Nottingham pe 07: 00-19: 00 ciclu lumină-întuneric la o temperatură de 20-22 ° C cu acces ad libitum la chow (2018 Teklad Global 18% Protein Rodents Diet; Harlan) și apă. Șoarecii masculi cu greutate potrivită au fost găzduiți individual și alocați fie unei diete proteice normale de control (NPD; 18% cazeină, 42,5% amidon de porumb, 21,3% zaharoză, 10% ulei de porumb, 5% celuloză; n = 8) sau izocaloric (în calorii/gm) LPD (9% cazeină, 48,5 amidon de porumb, 24,3% zaharoză, 10% ulei de porumb, 5% celuloză; n = 8) oferit ad libitum [Servicii dietetice speciale; compoziție publicată anterior (24, 52)] timp de 7 săptămâni înainte de inițierea împerecherii și menținută pe dietele respective până la eliminarea la vârsta de 32 săptămâni (Fig. 1).

Femelele C57BL/6 virgine, hrănite cu chow, de 7 până la 9 săptămâni, au fost plasate în cuști singure fie cu știfturi NPD, fie cu LPD, cu acces ad libitum la dieta respectivă a știfturilor. Prezența unui dop vaginal în dimineața următoare a fost luată ca un semn de împerechere. Femelele plug-pozitive au fost adăpostite singure și menținute pe chow până la descărcarea descendenților, moment în care au fost sacrificate. La naștere, descendenții au fost cântăriți și s-a determinat raportul de sex masculin la femeie. La vârsta de 3 săptămâni, toți descendenții au fost înțărcați, iar sexele au fost plasate în cuști separat pe așternut cu acces la chow și apă ad libitum și au fost alocate aleatoriu semne de coadă cu marker permanent pentru urmărirea ulterioară săptămânală a indivizilor. Toți descendenții au fost cântăriți săptămânal de la naștere până la vârsta de 24 săptămâni. Toate știfturile au generat câte 2 litere; cu toate acestea, în timpul dezvoltării de preîncărcare, 2 litere NPD și 2 LPD, fiecare din știfturi separate, s-au pierdut din cauza pruncuciderii materne. Ca atare, au fost analizate un total de 14 litri per tratament dietetic.

Măsurarea tensiunii arteriale.

Tensiunea arterială (sistolică și diastolică) și frecvența cardiacă au fost măsurate la bărbații stud la vârsta de 11 ani (hrănire pre-alimentată), 17 (prematurare) și 27 săptămâni și toți generau descendenți din toate cele 14 litri pe grup de tratament (n = 42 bărbați NPD, 43 femele NPD, 27 bărbați LPD și 42 femele LPD în total) la vârsta de 6, 10, 14 și 18 săptămâni prin utilizarea unui sistem computerizat, neinvaziv, cu coș (Kent Scientific). Toți șoarecii au fost aclimatizați în camera experimentală timp de cel puțin 1 oră, urmată de o încălzire minimă de 30 min la 27-30 ° C înainte de a fi introduși în aparatul de reținere și măsurare timp de 5 minute înainte de măsurare.

Test de toleranță la glucoză.

Toleranța la glucoză a descendenților a fost determinată la cel puțin un bărbat și o femelă pe așternut la vârsta de 22 săptămâni. Pui au fost postiti peste noapte, cu acces la apa ad libitum, si au fost cantariti imediat inainte de testul de toleranta la glucoza. După administrarea de anestezic local (cremă EMLA, Amestec Eutectic de Anestezice Locale, Lidocaină/Prilocaină; AstraZeneca), nivelurile de glicemie în jeun au fost determinate într-o probă colectată din vena cozii folosind un glucometru manual (Freestyle Optium) înainte de o glucoză intraperitoneală bolus (2 g/kg corp în greutate în PBS). Probele de sânge au fost colectate din vena cozii la 15, 30, 60 și 90 min postbol pentru determinarea concentrației de glucoză. Toate animalele au fost readuse în cușca lor originală cu acces la hrană și apă ad libitum.

Vasoreactivitatea arterei mezenterice.

Descendenți (n = 8 perechi de descendenți masculi și feminini pe grup de tratament, fiecare pereche din așternuturi separate) funcția vasculară a fost evaluată la vârsta de 24 săptămâni în segmente izolate de arteră mezenterică mici, așa cum este descris anterior (51) pe un miograf cu sârmă (Danish Myo Technology A/S ). Curbele de răspuns la concentrația cumulativă au fost măsurate pentru fenilefrina α1-adrenergică agonistă (10-9 până la 10-4 mol/l) și după preconstricția submaximală (EC80) cu tromboxanul mimetic U46619 (10 mmol/l), vasodilatatoarele ACh (10 −9 până la 10 −5 mol/l) și izoprenalină (Iso; 10 −10 până la 10 −6 mol/l) și donatorul de oxid nitric (NO) nitroprusid de sodiu (SNP; 10 −11 până la 10 −5 mol/l )) în această ordine în aceleași artere. Toate medicamentele au fost achiziționate de la Sigma (Marea Britanie).

Prelevarea de țesuturi.

Toți șoarecii au fost eliminați prin dislocare cervicală. La vârsta de 32 de săptămâni, masculii herghelii au fost eliminați, iar probele de sânge, prelevate prin puncție cardiacă, au fost lăsate să se coaguleze pe gheață înainte de centrifugare la 10.000 rpm, 4 ° C timp de 10 minute, după care serul a fost alicotat și depozitat la -80 ° C. Ficatul, rinichii, inima, plămânii, testiculele și grăsimea retroperitoneală, gonadală, inghinală și interscapulară [locațiile anatomice definite anterior (52)] au fost îndepărtate, cântărite și depozitate la -80 ° C. Epididimul caudal stâng și drept au fost îndepărtat și plasat într-o picătură pre-încălzită de 200 μl de mediu de motilitate a spermei (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 și 30 mM HEPES; proaspăt suplimentat cu 10 mM acid lactic, 1 mM piruvat de sodiu, 20 mg/ml BSA și 25 mM NaHCO3). Epididimii au fost tăiați de mai multe ori folosind un ac de calibru 23 și lăsați timp de 15 minute la 37 ° C pentru ca sperma să poată înota. O probă de spermă a fost luată pentru numărare folosind o cameră de numărare Neubeur înainte de evaluarea motilității. Spermatozoizii colectați au fost pipetați sub 2 ml de mediu de motilitate preîncălzit și lăsați să înoate timp de 1 oră la 37 ° C. Spermatozoizii din primii 1,5 ml de mediu au fost colectați și numărați ca mai sus. La vârsta de 24 săptămâni, descendenții au fost eliminați pentru colectarea de sânge și țesuturi somatice (așa cum s-a descris mai sus).

Măsurători ale metaboliților și hormonilor.

După eliminarea la vârsta de 32 de săptămâni, glucoza serică a șeptelului a fost analizată folosind o analiză comercială a glucozei oxidazei (Sigma) și a nivelurilor serice de insulină și testosteron determinate de ELISA (sistemele Millipore și, respectiv, R&D). Testele stud au fost omogenizate (50 mM HEPES, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS) înainte de determinarea nivelului de proteină (test DC, Bio-Rad Laboratories, CA, SUA). Nivelul testosteronului a fost determinat folosind un ELISA comercial (sisteme de cercetare și dezvoltare). Nivelurile de adiponectină și TNF-α au fost determinate în serul descendenților la sacrificare prin ELISA (R&D Systems). Toate testele au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile producătorului și măsurate pe un cititor de microplăci Benchmark (Bio-Rad Laboratories).

Extracția ARN și exprimarea transcrierii.

ARN-ul a fost extras din țesuturile cardiace și hepatice ale descendenților folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul genomic contaminant a fost îndepărtat prin digestie pe coloană a DNazei I înainte de sinteza ADNc folosind kitul ImProm II (Promega) folosind primerii aleatori incluși. Pentru PCR în timp real (RTqPCR), 1 μl (echivalent ARN de 5 ng) de ADNc a fost adăugat la un mastermix cuprinzând 10 μl mastermix (2X Precision SYBRgreen Mastermix; PrimerDesign), 0,7 μl amestec de primer (5 μM primeri înainte și invers), și 8,3 μl de apă per reacție. Apa a fost utilizată în locul ADNc ca control fără șablon. Amplificarea și detectarea au fost efectuate folosind un Lightcycler 480 (Roche) și datele obținute utilizând software-ul LightCycler SW 1.5.lnk. O curbă de topire post-amplificare a confirmat prezența unor produse specifice pentru fiecare set de grund. Valorile Ct au fost convertite în valori relative ale expresiei folosind metoda ΔΔ Ct cu date cardiace descendente normalizate la expresia Ppib și Sdha iar datele despre ficat s-au normalizat la Pgk1 și Tbp. software-ul geNorm (48) a fost utilizat pentru a determina acestea să fie cele mai stabile gene de referință. Secvențele primare și eficiența amplificării sunt furnizate în Tabelul 1.

Tabelul 1. Detalii despre exemplul PCR cantitativ în timp real

Analize statistice.

După caz, datele de sex masculin stud au fost analizate folosind eșantioane independente sau măsuri repetate t-teste, după evaluarea normalității și corelația Pearson pentru analiza corelației dintre măsurătorile fenotipice (versiunea SPSS 17). Rapoartele de sex cu puietul descendenților au fost analizate folosind un test binomial (versiunea SPSS 17). Analiza reacției vasculare a descendenților a fost realizată folosind GraphPad Prism 6, cu concentrația efectivă log egală cu 50% din răspunsul maxim (pEC50) și răspunsul maxim pentru fiecare dintre curbele de răspuns la concentrație analizate cu probe independente t-Test. Toate celelalte date despre descendenți au fost analizate folosind un model de regresie cu efecte aleatorii pe mai multe niveluri (versiunea SPSS 18) (53), luând în considerare originea paternă a așternutului, dimensiunea gestațională a așternutului, sexul descendenților și greutatea corporală. Semnificația a fost luată la P 6 ± 2,30 × 106/ml; LPD, 11,62 × 10 6 ± 1,99 × 10 6/ml) sau numărul de spermatozoizi colectați după înotare (NPD, 4,99 × 10 6 ± 1,29 × 10 6/ml; LPD, 4,68 × 10 6 ± 0,72 × 10 6/ml) au fost observate între grupurile de știfturi.

FIG. 1.Greutatea corporală medie săptămânală a dietei normale cu proteine ​​(NPD; ○; n = 8) și dietă săracă în proteine ​​(LPD; ●; n = 8) masculi herghelii. Hrănirea experimentală a început la vârsta de 11 săptămâni și a continuat până la eliminarea la 32 săptămâni. Împerecherea la femelele hrănite cu chow a început la vârsta de 18 săptămâni. Barele de eroare sunt SE. *P

LPD paternă afectează raportul de sex al descendenților, greutatea la naștere și fenotipul adulților.

Greutatea maternă medie înainte de concepție (16,28 ± 0,11 g) și după 2 săptămâni de sarcină (23,80 ± 0,29 g) și dimensiunea medie a așternutului (5,7 ± 0,4) nu au diferit între grupurile de tratament. Cu toate acestea, proporția puilor de sex masculin la naștere a fost redusă în LPD comparativ cu grupul de tratament NPD (NPD, 0,54 ± 0,04; LPD, 0,40 ± 0,06; P = 0,03), iar greutatea la naștere a descendenților masculi a fost crescută (NPD, 1,26 ± 0,02 g; LPD, 1,33 ± 0,02 g; P = 0,05). Descendenții LPD au fost, de asemenea, mai grei decât descendenții NPD la vârsta de 2 săptămâni (NPD, 6,54 ± 0,07 g; LPD, 7,13 ± 0,08 g; P = 0,006) și vârsta de 3 săptămâni (NPD, 7,82 ± 0,10 g; LPD, 8,61 ± 0,14 g; P = 0,019). La înțărcare, sexele au fost plasate în cuști separat (media a 3 bărbați NPD, 2 bărbați LPD, 3 femele NPD și 3 femele LPD pe cușcă), fără alte diferențe de greutate corporală observate între descendenții NPD și LPD până la 24 vârstă (datele nu sunt afișate).

Analiza corelațiilor dintre fenotipul patern la momentul împerecherii și dezvoltării postnatale precoce a descendenților a relevat corelații negative semnificative între greutatea corporală a știftului LPD și raportul mediu bărbat-femeie la așternut (r = -0,444, P

FIG. 2.Sistolic (A), diastolic (B) și medie (C) tensiunea arterială și ritmul cardiac [bătăi/min (BPM); D] la descendenții NPD (bare albe) și LPD (bare negre) la vârsta de 18 săptămâni. Barele de eroare sunt SE. *P

La vârsta de 22 săptămâni, atât descendenții LPD de sex masculin, cât și de sex feminin au prezentat concentrații crescute de glucoză în sânge în urma unui bolus de glucoză intraperitoneală. La 15 și 60 min postinjecție, bărbații LPD au avut concentrații semnificativ crescute de glucoză din sânge, cu un clearance global redus la 60 și 90 min (zona de sub curbă, ASC; P = 0,034 și respectiv 0,029) (Fig. 3A). Femelele LPD au avut în mod similar concentrații crescute de glucoză din sânge la 15 și 30 de minute după injectare și au eliminat clearance-ul general la 60 și 90 de minute (ASC; P = 0,022 și respectiv 0,080) (Fig. 3B).

FIG. 3.Modificări medii ale nivelului de glucoză din sânge după un bolus de glucoză intraperitoneală (2 g/kg corp greutate) la bărbațiA) și femininB) NPD (○) și LPD (●) descendenți la vârsta de 22 săptămâni. Barele de eroare sunt SE. *P

La vârsta de 24 săptămâni, răspunsurile vasoconstrictoare atenuate semnificativ (pEC50) la fenilefrina α-1 agonistă adrenergică (PE) și răspunsurile vasodilatatoare maxime la Iso și SNP donator de NO au fost observate în arterele de la bărbații LPD (Fig. 4A, P

FIG. 4.Vasoreactivitatea medie a arterelor mezenterice izolate de la mascul (A) și femininB) NPD (○) și LPD (●) descendenți la vârsta de 24 de săptămâni. Sunt prezentate adăugări cumulative de fenilefrină (PE) și, după preconstricție, ale vasodilatatoarelor ACh, izoprenalină (Iso) și nitroprusidă de sodiu (SNP). Barele de eroare sunt SE. *P

Tabelul 2. Concentrațiile serice de adiponectină și TNF-α

Sex Bărbați Femei Semnificație (P) DietaNPDLPDNPDLPDDietSexDiet × SexAdiponectină, μg/ml8,82 ± 0,298,95 ± 0,3013,62 ± 0,2913,20 ± 0,29-

Tabelul 3. Expresia transcrierii țesutului descendenților

Țesut și GeneNPDLPDP ValoareInima Adcy51,00 ± 0,020,93 ± 0,020,026 Fto1,00 ± 0,010,88 ± 0,02 Universitatea din Nottingham Advanced Research Fellowship (către A. J. Watkins) și o societate pentru reproducere și fertilitate Academic Scholarship Fund Award (către K. D. Sinclair).

Niciun conflict de interese, financiar sau de altă natură, nu este declarat de autor (i).

Contribuțiile autorului: A.J.W. concepția și proiectarea cercetării; A.J.W. efectuat experimente; A.J.W. și K.D.S. date analizate; A.J.W. și K.D.S. interpretarea rezultatelor experimentelor; A.J.W. figuri pregătite; A.J.W. manuscris redactat; A.J.W. și K.D.S. manuscris editat și revizuit; A.J.W. și K.D.S. versiunea finală aprobată a manuscrisului.

MULȚUMIRI

Mulțumim Wing Yee Kwong pentru asistență tehnică și sfaturi.