Zhaohong Qin

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

eliberarea

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Xun Zhou

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Mariana Gomez-Smith

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Nihar R. Pandey

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

Kevin F. H. Lee

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Diane C. Lagace

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Jean-Claude Béïque

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

Hsiao-Huei Chen

1 Centrul de recuperare a accidentului vascular cerebral, neuroștiințe, Institutul de cercetare al spitalului din Ottawa și

2 secții de medicină celulară și moleculară și

3 Medicină, Universitatea din Ottawa, Ottawa, Ontario K1H 8M5, Canada

Contribuțiile autorului: Z.Q., J.-C.B. și H.-H.C. cercetare proiectată; Z.Q., X.Z., M.G.-S., N.R.P., K.L. și H.-H.C. cercetări efectuate; H.-H.C. a contribuit cu reactivi/instrumente analitice nepublicate; Z.Q., X.Z., M.G.-S., N.R.P., D.C.L., J.-C.B. și H.-H.C. date analizate; Z.Q., J.-C.B. și H.-H.C. a scris ziarul.

Abstract

Introducere

Activitatea neuronală și sinaptică poate codifica și stoca informații în creier nu numai prin modificări ale puterii sinaptice, ci și prin controlul pe termen lung al expresiei genetice. Experiența exercită acest control parțial prin modularea nivelului și/sau funcției mai multor proteine ​​reglatoare dependente de calciu implicate în reglarea genelor (Flavell și Greenberg, 2008). Au fost dezvoltate o serie de abordări experimentale pentru depistarea factorilor de transcripție care reglementează expresia genelor implicate în multe aspecte ale dezvoltării neuronale, inclusiv ramificarea dendritică, maturizarea sinapselor și eliminarea sinapselor (pentru o revizuire, vezi Flavell și Greenberg, 2008). O provocare corolară devine identificarea genelor în aval de aceste proteine ​​de reglare a genei dependente de activitate și, în cele din urmă, pentru a lega aceste programe genetice cu măsuri celulare și comportamentale definite.

Folosind un ecran de capcană pentru transactivator, proteina LIM din domeniul 4 (LMO4) a fost identificată doar ca un transactivator care răspunde la calciu (Aizawa și colab., 2004) care activează expresia genelor într-o manieră dependentă de activitate (Kashani și colab., 2006). LMO4 este o proteină mică (165 aa) care conține două domenii LIM care interacționează cu proteinele. LMO4 servește nu numai ca un cofactor al multor factori de transcripție (Manetopoulos și colab., 2003; Kashani și colab., 2006; Schock și colab., 2008), ci interacționează și cu receptorii transmembranari pentru a le modula semnalizarea (Novotny-Diermayr și colab. ., 2005; Bong și colab., 2007). Nu se cunoaște dacă LMO4 cuplează semnale de la receptorii de membrană la modificări ale expresiei genei, deși am arătat că LMO4 este prezent în citoplasmă și nucleu și se translocează din citoplasmă în nucleu ca răspuns la stimuli extracelulari (Chen și colab., 2007a).

LMO4 este exprimat devreme în timpul dezvoltării SNC (Kenny și colab., 1998; Chen și colab., 2002). Șoarecii cu ablație germinală a LMO4 mor înainte de naștere cu exencefalie (Hahm și colab., 2004; Tse și colab., 2004; Lee și colab., 2005), în timp ce șoarecii cu ablație condiționată a LMO4 în cortexul cerebral prezintă defecte în conexiunile talamocorticale. (Kashani și colab., 2006). Cu toate acestea, procesele celulare care ar putea fi responsabile pentru acest defect sunt slab definite, ilustrând parțial lipsa relativă de date experimentale cu privire la rolurile funcționale jucate de această proteină reglementată de activitate.

Aici, urmând un exemplu dintr-un ecran de microarrays care a identificat reglarea descendentă a receptorului de ryanodină 2 (RyR2) în neuronii corticali LMO4-nul, am caracterizat rolul LMO4 ca un regulator atât al expresiei, cât și al funcției RyR2. În acest scop și pentru a ocoli letalitatea eliminării liniei germinale, am generat șoareci cu ablație postnatală a LMO4 prin împerecherea șoarecilor flox LMO4 cu șoareci care exprimă Cre-recombinază sub controlul unei minigene CaMK2α (Casanova și colab., 2001). Înregistrările electrofiziologice și imagistica cu calciu au arătat că mașinile de eliberare a calciului induse de calciu (CICR) au fost grav compromise în hipocampusul șoarecilor CamK2αCre/LMO4 flox (LMO4 KO), care s-au tradus direct în metricele de excitabilitate modificate ale neuronilor piramidali CA3 și plasticității sinaptice hipocamp. Aceste fenotipuri celulare ale hipocampului au fost însoțite de deficite de învățare, astfel cum s-a determinat în testul labirintului de apă Morris.

Materiale și metode

Șoareci Camk2αCre/LMO4 flox.

Șoarecii LMO4 KO și LMO4 flox au fost genotipați și menținuți pe un fundal CD-1 așa cum s-a descris anterior (Schock și colab., 2008; Zhou și colab., 2012). Șoarecii CamK2αCre/LMO4 flox și controalele CamK2αCre/(LMO4 flox/-) (LMO4 Het) sau LMO4 flox/flox (WT) potrivite în funcție de vârstă au fost utilizate în toate experimentele. Toate procedurile de utilizare a animalelor au fost aprobate de Universitatea din Ottawa pentru îngrijirea animalelor și serviciul veterinar și au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale și în conformitate cu cele ale Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor.

Cultura celulară și transfecție.

Celulele F11, un hibridom între neuronii ganglionului rădăcinii dorsale E12 de șobolan și o linie de neuroblastom de șoarece, au fost menținute așa cum s-a descris anterior (Chen și colab., 2007a, b). Pentru RT-PCR cantitativă, celulele F11 au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri și transfectate 24 de ore mai târziu prin utilizarea lipofectaminei 2000 (Invitrogen).

Constructorul promotorului RyR2 și testul activității.

Regiunea promotorului RyR2 care se întinde de la -765 la -104 (+1 fiind site-ul de pornire a transcripției putative) a fost amplificată prin PCR din ADN-ul genomic al cozii de șoarece, așa cum s-a descris anterior (Pfeffer și colab., 2009) folosind următorii primeri: înainte, 5- TTctcgagCGCATTCAGTGATCG-3; invers, 5-TTaagcttGACCTCAAGTCCAAGG-3 (litere mici reprezintă secvențe de linie XhoI și HindIII). Fragmentul RyR2 XhoI/HindIII a fost donat în vectorul reporter pGL4.10-Basic luciferază (Promega) și verificat prin secvențiere. Pentru testele de activitate a promotorului, 1 μg de promotor de luciferază RyR2 a fost cotransfectat cu 100 ng de reporter CMV-β-galactozidază în prezența a 400 ng de vector de expresie LMO4 sau LMO4 shARN în celule F11 în plăci cu 6 godeuri. S-a folosit ca martor vectorul gol adecvat sau shRNA amestecat. Celulele au fost recoltate la 24 de ore după transfecție, iar activitatea luciferazei conduse de promotorul RyR2 a fost normalizată la β-galactozidază pentru a controla eficiența transfecției, așa cum s-a descris anterior (Chen și colab., 2007b; Gomez-Smith și colab., 2010).

Extracția ARN și RT-PCR cantitativă.

Probabilitatea de eliberare a fost estimată prin analiza varianței amplitudinilor EPSC (Malinow și Tsien, 1990; Martín și Buño, 2003). Am estimat efectele cofeinei asupra probabilității de eliberare prin reprezentare grafică (medie pătrată/varianță cafeină)/(medie pătrată/varianță linie de bază) față de (amplitudine maximă cafeină/vârf amplitudine linie de bază) și ajustări liniare calculate (Bekkers și Stevens, 1990; Faber și Korn, 1991; Manabe și colab., 1993; Martín și Buño, 2003).

Cultură organotipică a feliei.

Culturile de felie de hipocamp au fost preparate de la șoareci de 6 până la 8 d, așa cum s-a descris anterior (Stoppini și colab., 1991; Béïque și Andrade, 2003; Béïque și colab., 2007). Transfecțiile biolistice au fost efectuate cu 3–6 zile mai târziu cu pistolul Helios Gene (Bio-Rad), folosind particule de aur de 1,0 μm acoperite cu ADN. Particulele de aur au fost acoperite cu două ADNc: dsRed și LMO4-EGFP. Am arătat anterior că neuronii transfectați în mod eficient exprimă ambele plasmide în> 90% din cazuri (Béïque și Andrade, 2003).

Imagistica cu calciu cu doi fotoni.

Înregistrări electrofiziologice și optice simultane au fost efectuate din celule piramidale CA3 utilizând condiții similare celor descrise mai sus în secțiunea de electrofiziologie (pentru înregistrări cu curent-clamp), cu excepția faptului că soluția de pipetă intracelulară a fost suplimentată cu Alexa Fluor 594 (30 μm; ) și cu indicatorul de calciu Fluo-4FF (200 μ m). Am favorizat inițial această vopsea cu afinitate scăzută (și capacitate redusă) pentru a evita saturația vopselei în urma trenurilor de potențial de acțiune în condiții de CICR îmbunătățit. Imaginea a fost obținută pe un Olympus FV 1000 cu un obiectiv 40 ×/0,8 NA, iar excitația a fost obținută cu un laser Mai Tai Deep See Ti: Sapphire laser (Spectra-Physics) acordat la 810 nm. Analiza a fost efectuată off-line folosind ImageJ. Valorile ΔF/F0 au fost calculate prin media intensităților fluorescenței în două sau trei ROI selectate, situate pe soma, dar excluzând nucleul și au fost exprimate după cum urmează: ΔF/F0 = (F - Fbaseline)/(Fbaseline - Fbackground). Achiziția de imagini a avut loc pe soma neuronală și nu s-au depus eforturi speciale pentru a regla achiziția la planurile focale care cuprind dendrite proximale.