Conectați-vă folosind numele de utilizator și parola

Meniu principal

Conectați-vă folosind numele de utilizator și parola

Esti aici

  • Acasă
  • Arhiva
  • Volumul 53, numărul 10
  • Enteropatia precede diabetul de tip 1 la șobolanul BB

  • Articol
    Text
  • Articol
    info
  • Citare
    Instrumente
  • Acțiune
  • Răspunsuri
  • Articol
    valori
  • Alerte
  1. Cu Graham 1,
  2. P Courtois 2,
  3. W J Malaisse 2,
  4. J Rozing 3,
  5. F W Scott 4,
  6. A Mc I Mowat 1
  1. 1 Departamentul de Imunologie și Bacteriologie, Universitatea din Glasgow, Western Infirmary, Glasgow, Marea Britanie
  2. 2 Laborator de Hormonologie Experimentală, Universitatea Liberă din Bruxelles, Bruxelles, Belgia
  3. 3 Departamentul de biologie celulară, secția de imunologie, Facultatea de Științe Medicale, Universitatea din Groningen, Groningen, Olanda
  4. 4 Programul de Medicină Moleculară, Institutul de Cercetări în Sănătate din Ottawa, Universitatea din Ottawa, Ottawa, Ontario, Canada
  1. Corespondență cu:
    Profesorul A Mowat
    Departamentul de Imunologie și Bacteriologie, Universitatea din Glasgow, Western Infirmary, Glasgow G11 6NT, Marea Britanie; a.m.mowatclinmed.gla.ac.uk

Abstract

Context și obiective: Există dovezi crescânde ale implicării răspunsurilor imune intestinale la proteinele dietetice în patogeneza diabetului autoimun de tip 1 (T1D). Aici am investigat asocierea dintre patologia intestinală și factorii dietetici în T1D prin examinarea arhitecturii mucoasei în modelul șobolan BB.

enteropatia

Metode: Șobolanii cu control BB (BBc) și cu predispoziție pentru diabet (BBdp) au fost hrăniți fie cu o dietă bazată pe cazeină hidrolizată, fie cu una dintre cele două diete pe bază de cereale care promovează dezvoltarea diabetului. Arhitectura intestinală a fost evaluată în jejun prin microdisecție, histologie și imunohistologie și prin măsurarea activității peroxidazei și a nivelurilor de invertază la marginea pensulei.

Rezultate: Enteropatia a fost prezentă la șobolanii BBdp la scurt timp după înțărcare, evaluată prin creșterea lungimii criptei și a activității proliferative a celulelor epiteliale ale criptelor din jejun și aceasta a rămas constantă până la vârsta de 120 de zile. A existat, de asemenea, o scădere a activității invertazei, precum și un număr crescut de limfocite intraepiteliale, niveluri crescute de activitate a peroxidazei mucoasei și infiltrarea mucoasei de către limfocitele CD4 + T. Enteropatia echivalentă a fost prezentă în permanență la șobolanii BBdp și nu a fost influențată de natura dietei sau de timectomie la vârsta de trei săptămâni, proceduri care previn dezvoltarea diabetului.

Concluzie: Enteropatia este o caracteristică consecventă la șobolanul BB predispus la diabet, dar precede apariția insulitei și pare a se datora unor mecanisme distincte de cele care cauzează diabet. Efectele benefice ale dietei de cazeină hidrolizate cu rezistență la diabet nu se datorează unui efect asupra arhitecturii intestinale în sine, dar pot fi necesare leziuni ale mucoasei pentru dezvoltarea autoreactivității în pancreas.

  • T1D, diabet autoimun de tip 1
  • BBc, șobolani de control BB
  • BBdp, șobolani predispuși la diabet
  • tTG, transglutaminază tisulară
  • WG, gluten de grâu
  • HC, cazeină hidrolizată
  • CCPR, rata de producție a celulei criptă
  • IEL, limfocite intraepiteliale
  • DC, celulă dendritică
  • diabet de tip 1
  • enteropatie
  • dietă
  • Celule T CD4 +

Statistici de pe Altmetric.com

  • T1D, diabet autoimun de tip 1
  • BBc, șobolani de control BB
  • BBdp, șobolani predispuși la diabet
  • tTG, transglutaminază tisulară
  • WG, gluten de grâu
  • HC, cazeină hidrolizată
  • CCPR, rata de producție a celulei criptă
  • IEL, limfocite intraepiteliale
  • DC, celulă dendritică
  • diabet de tip 1
  • enteropatie
  • dietă
  • Celule T CD4 +

Diabetul de tip 1 (T1D) este asociat cu distrugerea autoimună a celulelor β producătoare de insulină în insulele pancreatice datorită unei defecțiuni determinate genetic a autotoleranței. Deși susceptibilitatea la T1D este strâns legată de mai multe gene de origine MHC și non-MHC, factorii de mediu joacă, de asemenea, un rol important. 1, 2 Unul dintre acești factori este dieta, iar noi și alții am arătat că incidența diabetului spontan la șobolanii BB 2-5 sau la șoarecii NOD 6-9 este redusă la animalele hrănite cu o dietă care conține cazeină hidrolizată sau alt aminoacid ignifug. surse.

Prin urmare, este important să se determine natura exactă a relației dintre afectarea intestinului, răspunsurile imune la proteinele alimentare și diabetul. Ca prim pas către acest scop, aici am examinat prezența enteropatiei la șobolanii de control BB (BBc) și diabetici predispuși (BBdp) și am determinat efectele dietelor cu potențial diferit de inducere a diabetului.

MATERIALE ȘI METODE

Animale

Șobolanii cu predispoziție de diabet masculin și feminin (BBdp) și șobolanii BB de control (BBc) utilizați în studiile dietetice au fost obținuți de la Divizia de resurse animale din Health Canada (Ottawa, Canada). Pentru experimentele de timectomie, șobolanii BB predispuși la diabet (BBDP/Gro) și șobolanii rezistenți la diabet (BBDR/Gro) obținuți inițial de la Universitatea din Massachusetts (Worcester, Massachusetts, SUA) au fost crescuți la unitatea centrală pentru animale a Universității din Groningen. Toate animalele au fost crescute în condiții specifice fără patogeni și înțărcate la vârsta de 23 de zile. Animalelor li s-a oferit acces gratuit la alimente și apă. Experimentele au fost aprobate de comitetele de îngrijire a animalelor din fiecare instituție și au fost respectate principiile de îngrijire a animalelor de laborator, așa cum este descris de Consiliul canadian pentru îngrijirea animalelor sau de legea olandeză privind utilizarea animalelor de experiment.

Dietele

În studiile pe animale efectuate în Ottawa, șobolanii au fost hrăniți cu o dietă NTP-2000 (NTP) (Zeigler Bros., Gardners, Pennsylvania, SUA) care este în principal pe bază de plante (fără lapte), cu grâu ca componentă majoră (37%), și conține aproximativ 14,6% proteine, 8,2% grăsimi, 9,9% fibre brute, 52% carbohidrați și 10,7% umiditate. Dieta a fost iradiată înainte de utilizare și conținea niveluri scăzute de contaminanți chimici și microbieni. 28 Au fost utilizate două diete de testare semi-purificate izocalorice și izonitrogene: o dietă cu gluten de grâu (WG) constând din 22,5% gluten de grâu (ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio, SUA) și o dietă de cazeină hidrolizată (HC) conținând 20,0% hidrolizat de cazeină S enzimatic hidrolizat; Sensient Flavors Canada Inc., Mississauga, Ontario, Canada) ca sursă de aminoacizi. Pentru studiile efectuate pe șobolani timectomizați în Groningen, șobolanii au fost hrăniți cu o dietă standard de rozătoare pe bază de cereale (Hope Farms, dietă de rozătoare nr. Rmh-B2181; Woerden, Olanda).

Evaluarea arhitecturii intestinale

A fost utilizată metoda Clarke, așa cum a fost descris anterior. 29, 30 Pe scurt, bucăți de jejun la 10 cm de pilor au fost fixate în 75% etanol și 25% acid acetic glacial și colorate cu reactiv Schiff (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, SUA). Folosind un microscop de disecție, secțiunile cu o unitate de villus/criptă grosime au fost tăiate și lungimile de villus și criptă au fost determinate folosind un micrometru ocular. Zece vilozități și cripte au fost măsurate în fiecare secțiune. Țesuturile au fost apoi strivite ușor sub lamelă și s-a determinat numărul de corpuri mitotice pe criptă. În unele experimente, ratele de producție a celulelor criptice (CCPR) au fost măsurate prin injectarea șobolanilor intraperitoneal cu 7,5 mg/kg greutate corporală de colchicină și probe de jejun au fost colectate 30-90 minute mai târziu. Metafazele au fost numărate pentru fiecare punct de timp și numărul mediu de metafaze pe criptă a fost calculat și reprezentat grafic în funcție de timpul de după injectarea colchicinei. CCPR a fost calculat din gradientul liniei.

Evaluarea densității limfocitelor intraepiteliale (IEL)

IEL-urile au fost numărate pe secțiuni de jejun colorate cu hematoxilină-eozină încorporate în parafină și au fost exprimate ca numărul mediu de IEL la 100 de celule epiteliale. Un număr total de 600 de celule epiteliale au fost numărate în fiecare probă.

Măsurarea activităților invertazei și peroxidazei intestinale

Un segment de 1-2 cm de jejun proximal a fost omogenizat în 3 ml de apă distilată rece și congelat imediat. După decongelare și ultrasunete pe gheață, activitatea invertazei a fost măsurată folosind o metodă în doi pași. 31 de probe au fost incubate mai întâi cu [U-14 C] zaharoză (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts, SUA) în alicote de 100 μl de tampon HEPES-NaOH (50 mmol/l, pH 6,5) conținând 6 mmol/l MgCl2, 60 mmol/l KCl și 10 mmol/l KH2PO4 timp de 15 minute la 30 ° C. Reacția a fost oprită prin încălzire la 85 ° C timp de 10 minute și s-a măsurat eliberarea produselor marcate D- [U-14 C] glucoză și D- [U-14 C] fructoză. Acestea au fost fosforilate mai întâi în 500 alicote alilice prin incubare timp de două ore la 37 ° C, pH 7,5, cu 3,6 U/ml drojdie hexokinază (Roche, Mannheim, Germania) și 3,2 mmol/l ATP, separate prin cromatografie cu schimb de ioni, și cantitatea de produse radiomarcate numărată prin scintilație lichidă. Toate măsurătorile au fost făcute în trei exemplare.

Așa cum s-a descris anterior, activitatea 32 peroxidazei a fost măsurată la 30 ° C în omogenate tisulare diluate 1: 1 în 0,006% Triton, congelat-decongelat (3 ×) într-o baie de gheață uscată/acetonă, care au fost sonicate pe gheață, folosind un spectrofotometru, prin amestecarea a 100 µl de probă cu 3,4 ml tampon acetat (50 mmol/l, pH 5,4) conținând 0,3 M zaharoză, 1,4 mmol/l tetrametilbenzidină (Sigma) și 300 µM peroxid de hidrogen (Merck, Darmstadt, Germania). S-a măsurat modificarea absorbanței la 655 nm și 1 unitate de activitate peroxidază a fost definită ca o creștere a unei unități de absorbanță pe minut în condiții liniare.

Timectomie

Șobolanii BBDP/Gro și BBDR/Gro au fost timectomizați la vârsta de trei săptămâni, așa cum s-a descris anterior. 33 Completitudinea timectomiei a fost verificată prin absența migranților timici circulanți în sângele periferic și prin inspecția anatomică la necropsie. Șobolanii martori au fost supuși timectomiei simulate la aceeași vârstă.

Imunohistochimie

analize statistice

Comparațiile între grupuri au fost efectuate utilizând un ANOVA unidirecțional, testul t Student sau testul sumelor de rang Wilcoxon. CCPR au fost comparate utilizând analiza covarianței; Valorile p mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.

REZULTATE

Influența dietei asupra diabetului

Incidența medie a diabetului zaharat la șobolanii BBdp din colonia Ottawa care a alimentat dieta standard NTP a rămas constantă în ultimii cinci ani (media 65,3 (SD 14,9)%; total 169 șobolani). 11 Șobolanii hrăniți cu dieta WG au o incidență similară a diabetului (50,6 (11,1)%, n = 282) în timp ce cei hrăniți cu dieta HC sunt protejați de diabet într-o măsură considerabilă (18,8 (10,6)%; n = 322; p 30 Șobolanii BBdp hrăniți cu dieta WG au avut, în general, lungimi de villus reduse în comparație cu martorii pe tot parcursul studiului, dar acest lucru nu a fost semnificativ din punct de vedere statistic, cu excepția vârstei de 10 zile (fig 2). nu a fost văzut în alte momente.

Dieta și enteropatia la șobolanul BB. Lungimea Villus în jejunul șobolanilor predispuși la diabet BB (BBdp) și al șobolanilor de control (BBc) hrăniți cu diabet zaharat (NTP, gluten de grâu (WG)) sau protectoare (cazeină hidrolizată (HC)). Probele de jejun au fost analizate prin microdisecție de la 10 la 120 de zile. Rezultatele prezentate sunt mijloace (SD) pentru șobolani BBc și BBdp. * p 30, 34 Pentru a examina dacă acest lucru a apărut și la șobolanul BBdp, grupuri separate de șobolani BBdp și BBc au fost examinați în cel mai timpuriu moment în care enteropatia a fost evidentă (ziua 30). În acest moment, șobolanii BBdp au avut o creștere semnificativă a numărului de IEL în jejun comparativ cu controalele BBc (fig 4A).

Enteropatie la șobolanii predispuși la diabet BB (BBdp). Aspectul histologic al jejunului de la (A) martor (BBc) și (B) BBdp Șobolani vechi de 100 de zile hrăniți cu dieta NTP, prezentând alungirea criptelor (CL) și scurtarea vilozității (VS) (hematoxilină-eozină × 100).

Dieta și enteropatia la șobolanul BB. (A) Limfocitele intraepiteliale (IEL) se numără în șobolanii predispuși la diabet BB (BBdp) și șobolani de control (BBc) hrăniți cu diete de promovare a diabetului (NTP) sau de protecție (cazeină hidrolizată (HC)). Secțiunile de jejun au fost colorate cu hematoxilină-eozină și s-a numărat numărul IEL la 100 de celule epiteliale (celule ** p + în lamina propria și celule CD8 + atât în ​​lamina propria cât și în epiteliu (fig 5). Colorare pentru αβ Receptorul de celule T a confirmat că aceste celule CD4 + și CD8 + erau celule T (datele nu sunt prezentate). În plus, celulele MHC + de clasa II erau abundente în lamina propria și dubla colorare pentru integrina αE a indicat că multe dintre acestea erau celule dendritice. (DC) (fig. 5). În comparație, șobolanii BBdp hrăniți cu dieta NTP au crescut semnificativ infiltrarea laminei proprii de către celulele T CD4 +, dar o absență virtuală a celulelor T CD8 + și a celulelor MHC + de clasa II. celulele au fost prezente în mucoasa BBdp, dar în număr redus comparativ cu BBc, sugerând o deficiență a numărului total de DC. A existat o lipsă completă a expresiei MHC de clasa II de către aceste celule (fig. 5). epiteliul oricărui șobolan.

Dieta și enteropatia la șobolanul BB. Apariția imunohistologică a jejunului la șobolani cu vârsta de 70 de zile predispuși la diabet BB (BBdp) și șobolani martor (BBc) hrăniți cu cazeină hidrolizată (HC) și cu diete NTP. Secțiunile înghețate au fost colorate pentru celulele MHC + CD4 +, CD8 + și clasa II folosind Alex Fluor 488 (verde) și pentru integrina αE utilizând Alex Fluor 647 (roșu). Nucleii au fost colorați cu DAPI (albastru) (mărire × 200).

Prezența inflamației intestinale la șobolanii predispuși la diabet a fost subliniată de o creștere a activității enzimei peroxidazei asociată cu celulele fagocitare. Acest lucru a fost văzut în ziua 30 (datele nu sunt prezentate) și a fost și mai marcat în ziua 95, când șobolanii BBdp au avut o creștere de șapte ori a nivelurilor de peroxidază duodenală în comparație cu controalele BBc (fig 4B; medie 362,3 (SEM 126,3) v 50,6 (13,8) mU/mg; celule T + p, celule T CD8 + sau celule MHC + de clasa II observate la șobolani BBdp (fig. 5).

Enteropatia la șobolanii diabetici este asociată cu anomalii funcționale ale enzimelor epiteliale

Pentru a determina dacă enteropatia la șobolanii BBdp a produs, de asemenea, modificări funcționale la nivelul intestinului și dacă acestea au fost influențate de dietă, am măsurat nivelurile activității invertazei la marginea pensulei.

La șobolanii BBc, activitatea duodenală a invertazei a arătat o creștere accentuată între 10 și 30 zile și o scădere târzie între 95 și 120 zile, indiferent de dietă (fig 6). În ziua 10, nu s-a observat nicio diferență semnificativă în activitatea invertazei între șobolanii BBc și BBdp, dar începând cu ziua 30, nivelurile de invertază au fost constant mai scăzute la șobolanii BBdp hrăniți cu diete care promovează dietele NTP și WG sau dietele protectoare HC decât la șobolanii BBc echivalenți. Aceste diferențe au fost semnificative statistic în zilele 30 și 70 la șobolanii hrăniți cu dieta NTP sau HC și în ziua 70 la animalele hrănite cu dieta WG (fig. 6). Nu s-au găsit diferențe semnificative între activitatea invertazei la șobolanii BBc hrăniți cu dieta HC și cei hrăniți fie cu dieta NTP, fie cu WG în orice moment.

Dieta și enteropatia la șobolanul BB. Activitatea inversazei în intestinul proximal al șobolanilor predispuși la diabet BB (BBdp) și șobolanilor de control (BBc) hrăniți cu diete NTP, gluten de grâu (WG) sau cazeină hidrolizată (HC), determinate așa cum este descris în material și metode. Rezultatele prezentate sunt medii (SEM) pentru 12 șobolani pe grup în ziua 10 și 3-5 pentru fiecare grup pentru fiecare punct de timp rămas (* p 35 și, prin urmare, am examinat efectele timectomiei asupra enteropatiei. Arhitectura mucoasă a fost măsurată în timectomizat și șobolani timectomizați BBDP/Gro sau BBDR/Gro în timpul fazei prediabetice (ziua 59) și în jurul momentului de debut al diabetului în ziua 84. S-a observat insulită medie până la severă în BBDP/Gro examinată la 84 de zile, dar nu s-a găsit insulită în oricare dintre șobolanii BBDP/Gro timectomizați examinați la 59 și 84 de zile și niciunul dintre șobolanii BB de control (datele nu sunt prezentate).

La fel ca în colonia Ottawa, șobolanii BBDP/Gro timectomizați au dezvoltat enteropatie în perioada prediabetică, cu hipertrofie criptă semnificativă în comparație cu controalele BBDR/Gro din ziua 59 (fig. 7). În ziua 84, a existat, de asemenea, o creștere a CCPR, măsurată printr-o tehnică de arestare metafazică. Un șablon similar de patologie intestinală a fost observat la șobolanii BBDP/Gro timectomizați, cu creșteri semnificative ale lungimii criptelor în ambele zile 59 și 84. Timectomia nu a avut niciun efect asupra arhitecturii mucoasei la șobolanii de control BBDR/Gro. Astfel, timectomia nu a avut niciun efect asupra enteropatiei, în ciuda capacității sale de a modifica rezultatul diabetului la șobolanii BBDP/Gro.

Faptul că enteropatia este independentă de diabet ridică întrebarea de ce enteropatia nu a apărut la șobolanii BBc care împart o mare parte din genele lor. 52 Una dintre cele mai bine înțelese diferențe genetice dintre cele două tulpini este prezența genei limfopeniei (lyp) la șobolanii BB predispuși la diabet și este posibil ca diabetul și enteropatia la șobolanii BB predispuși la diabet să fie consecințe independente ale mutației lyp. Asocierea genetică dintre limfopenie, diabet și enteropatie trebuie abordată în linii de șobolan BB congenice adecvate. În funcție de rezultatele acestei analize, este posibil ca susceptibilitatea genetică la enteropatie să fie unul dintre multiplii factori care contribuie la patogeneza T1D la om și va fi interesant să se determine dacă această caracteristică este prezentă în toate modelele experimentale de T1D.

În concluzie, acest studiu a demonstrat că șobolanii BB predispuși la diabet au o enteropatie asemănătoare bolii celiace care se stabilește de la o vârstă fragedă, oferind sprijin suplimentar pentru o legătură între intestin și patogeneza T1D. Faptul că dieta și timectomia, doi factori externi care s-au dovedit a modifica cursul diabetului, nu au avut niciun efect asupra măsurilor brute ale enteropatiei sugerează că aceste intervenții nu previn diabetul prin refacerea sau prevenirea leziunilor intestinale. Acest lucru nu exclude posibilitatea ca enteropatia să fie o trăsătură constitutivă care facilitează dezvoltarea diabetului indus de dietă. Analiza viitoare a patogeniei enteropatiei poate oferi un indiciu util asupra factorilor genetici predispozanți la T1D.

Mulțumiri

Această lucrare a fost finanțată de Fundația pentru Cercetarea Diabetului Juvenil, Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate, Fondul Ontario pentru Cercetare și Dezvoltare, Fundația Canada pentru Inovare și Health Canada. Mulțumim domnului J Souligny și domnului D Patry de la Divizia de resurse animale, Health Canada, pentru îngrijirea animalelor, și doamnei H Gruber pentru asistență tehnică. Mulțumim lui Flip Klatter pentru efectuarea timectomiilor în Groningen, Olanda, unde munca experimentală a fost susținută de granturi de la Fundația Olandeză pentru Diabet (DFN98.148 și DFN01.024). Mulțumim lui Robin Reid, Departamentul de Patologie, Universitatea din Glasgow, pentru asistență în studiile de histologie.