Text complet

Citații

Articole similare

BioEntități

Linkuri externe

Hervé Husson

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

europa

Sarah Moreno

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Laurie A. Smith

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Mandy M. Smith

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Ryan J. Russo

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Rose Pitstick

2 McLaughlin Research Institute, 1520 23rd Street South, Great Falls, Montana 59405, SUA

Mihail Sergeev

3 Harvard Institutes of Medicine, 4 Blackfan Circle HIM568, Boston, MA 02115, SUA

Steven R. Ledbetter

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Nikolay O. Bukanov

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Monica Lane

4 Departamentul de Spectrometrie de Masă Biologică și Cercetare a Biomarkerilor, Centrul de Cercetare-Dezvoltare Sanofi-Genzyme, 1 Mountain Road, Framingham, MA 01701, SUA

Kate Zhang

4 Departamentul de Spectrometrie de Masă Biologică și Cercetare a Biomarkerilor, Centrul de Cercetare-Dezvoltare Sanofi-Genzyme, 1 Mountain Road, Framingham, MA 01701, SUA

Katy Billot

5 ManRos Therapeutics, Hotel de Recherche-Centre de Perharidy, 29680 Roscoff, Franța

George Carlson

2 McLaughlin Research Institute, 1520 23rd Street South, Great Falls, Montana 59405, SUA

Jagesh Shah

3 Harvard Institutes of Medicine, 4 Blackfan Circle HIM568, Boston, MA 02115, SUA

Laurent Meijer

5 ManRos Therapeutics, Hotel de Recherche-Centre de Perharidy, 29680 Roscoff, Franța

David R. Beier

6 Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, Seattle Children's Research Institute, 1900 9th Avenue, Seattle, WA 98101, SUA

Oxana Ibraghimov-Beskrovnaya

1 Departamentul de boli rare, Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, 49 New York Avenue, Framingham, MA 01701, SUA

Date asociate

Abstract

Introducere

Recunoașterea rolului cililor primari în bolile umane a dus la progrese remarcabile în înțelegerea noastră a funcției acestui organet în dezvoltarea vertebratelor. Printre descoperirile inițiale care au determinat aceste investigații a fost descoperirea că o serie de proteine ​​implicate în boala renală polichistică umană (PKD) s-au localizat în ciliile primare. De atunci, cilii primari au fost caracterizați ca modulatori cruciale ai căilor de semnalizare a dezvoltării, inclusiv cei mediați de Hedgehog, Wnt, Notch și factorul de creștere derivat din trombocite alfa (1). Mutațiile genelor ale căror produse se localizează în cili sau sunt necesare pentru formarea sau funcționarea lor au fost implicate în tulburări cunoscute acum sub numele colectiv de ciliopatii, care se remarcă prin varietatea lor largă de simptome, inclusiv obezitatea, defectele retinei, defectele scheletice, anomaliile creierului și, după cum sa menționat, PKD (2-5).

CDK5 este o kinază multifuncțională care joacă un rol important în reglarea diverselor funcții celulare, inclusiv diferențierea, organizarea aderenței focale și a citoscheletului, dinamica membranei, metabolismul celular, oprirea ciclului celular în celulele post-mitotice și supraviețuirea celulară, după cum se revede în Ref. (30). Activitatea anormală a CDK5 a fost studiată activ în bolile neurodegenerative cu hiperactivare a CDK5 cu p25, produsul clivajului proteolitic dependent de calpain al p35 (31). Rolul CDK5 în țesutul non-neuronal nu este bine înțeles. Date recente sugerează posibila funcție a CDK5 neregulat într-o serie de afecțiuni renale, unde poate juca un rol patogen prin promovarea diferențierii celulare și a apoptozei (25,32-36).

În acest studiu, am investigat rolul specific al CDK5 în promovarea cistogenezei renale. Am emis ipoteza că arestarea de lungă durată a cistogenezei observată la tratamentul cu inhibitorul pan-CDK R-roscovitină este cel puțin parțial atribuită inhibiției CDK5 și restabilirii diferențierii celulare. Aici, raportăm că tratamentul cu puls al șoarecilor jck cu inhibitorii CDK R-roscovitină și S-CR8 are ca rezultat inversarea morfologiei epiteliale chistice la cea a celulelor epiteliale tubulare normale, normalizarea modelului de expresie a markerilor de diferențiere a celulelor renale. și atenuarea prelungirii anormale a cililor observată în rinichii jck. Pentru a investiga direct rolul CDK5 în PKD, am generat și caracterizat șoareci jck cu o genă Cdk5 inactivată condiționat. Arătăm că pierderea CDK5 reduce cistogeneza, îmbunătățește funcția rinichilor, reduce lungimea ciliară și normalizează morfologia celulelor epiteliale ale rinichilor cu căptușeală. Inhibarea selectivă a CDK5 promovează diferențierea celulară și restabilirea fenotipului celular normal și, prin urmare, reprezintă o opțiune de tratament viabilă pentru PKD.

Rezultate

Arestarea bolii chistice la șoareci jck cu R-roscovitină și S-CR8 este legată de o reducere de lungă durată a lungimii ciliare și de refacerea fenotipului epitelial renal

Noi și alții am arătat că cilii celulelor epiteliale renale sunt prelungite la șoareci jck (8,5 ± 2,5 µm) comparativ cu martorii de tip sălbatic (2,5 ± 1,5 µm) (15,37). Am examinat dacă reducerea progresiei bolii chistice conferită de tratamentul cu R-roscovitină (25) a avut un efect asupra lungimii ciliare a rinichilor tratați. Așa cum se arată în Figura 1, cilii sunt semnificativ alungiți în rinichi de la șoareci mutanți jck și tratamentul continuu cu R-roscovitină timp de 5 săptămâni atenuează această anomalie (Fig. 1 B și C). Important, această reducere a lungimii ciliare a fost menținută atunci când rinichii au fost examinați la 2 săptămâni după întreruperea tratamentului cu R-roscovitină (Fig. 1 B și C). Așa cum se arată în Figura 1 C, R-roscovitina restabilește lungimea ciliară la niveluri comparabile cu martorii greutății, dar nu abrogă formarea ciliilor. De remarcat, acest lucru nu se datorează expunerii persistente la medicament, deoarece analiza farmacocinetică arată că R-roscovitina este eliminată în 24 de ore după administrare (38).

Arestarea susținută a cistogenezei cu inhibitor CDK, R-roscovitina, reduce lungimea cililor și restabilește diferențierea celulară în rinichii jck. (A) Reprezentarea schematică a regimului de tratament. Șoarecii Jck au fost tratați cu control vehicul sau 150 mg/kg R-roscovitină prin injecții IP zilnic timp de 5 săptămâni (schema 1), sau timp de 3 săptămâni, urmate de 2 săptămâni fără tratament (schema 2) așa cum este descris (25). N = 23 pentru programul 1 și 20 pentru programul 2. (B) Scanarea micrografiilor electronice ale cililor primari în celulele epiteliale renale de la șoareci de tip sălbatic (wt) și șoareci jck tratați cu vehicul sau tratați cu R-roscovitină conform schemei 1 sau 2, așa cum sa menționat. (C) Cuantificarea și reprezentarea grafică a distribuției lungimii cililor a datelor prezentate în (B). P Fig. 1 B). Pentru a evalua dacă acest lucru s-a datorat eventual unei restabiliri a diferențierii celulare, am testat starea celulei prin imunotincere pentru markerii mezenchimali vimentina și actina mușchiului neted alfa (αSMA) și markerul epitelial citokeratină, care s-a dovedit a fi exprimat aberant în PKD (39,40). Am constatat că celulele epiteliale renale se află într-o stare nediferențiată la șoarecii jck, demonstrând o expresie crescută a vimentinei și αSMA în țesutul interstițial și celulele epiteliale chistice și o expresie scăzută a citokeratinei (Fig. 1 D). În schimb, acești markeri au apărut în mod normal exprimați în rinichi de la șoareci jck tratați cu R-roscovitină, chiar și la 2 săptămâni după retragerea tratamentului (Fig. 1 D).

Am investigat în mod similar efectul in vivo al S-CR8, un analog mai puternic și selectiv din a doua generație a R-roscovitinei (27,41). Având în vedere eficacitatea robustă a tratamentului pulsului cu R-roscovitină la șoarecii jck, am comparat regimurile de tratament continuu și pulsul S-CR8. Pentru aceasta, am folosit mai multe scheme de tratament: 24 mg/kg de S-CR8 a fost administrat zilnic timp de 5 săptămâni (schema 1); sau timp de 3 săptămâni, urmate de 2 săptămâni fără tratament (schema 2) sau timp de 1 săptămână, urmate de 4 săptămâni fără tratament (schema 3) (Fig. 2 A). Administrarea S-CR8 conform schemelor 1 și 2 a arătat reduceri similare ale cistogenezei în comparație cu șoarecii netratați, după cum se arată prin scăderi semnificative ale raportului greutate rinichi/corp (rinichi/BW), volumul chistic și azot uree din sânge (BUN), Tabelul C1 ). Metricele bolii la șoarecii tratați folosind schema 3 au fost crescute comparativ cu cele observate în schemele 1 sau 2, sugerând că efectul terapeutic scade după o perioadă prelungită (4 săptămâni) fără tratament (Material suplimentar, tabelul S1).

Direcționarea specifică a CDK5 duce la scurtarea cililor in vitro

Deoarece atât R-roscovitina, cât și S-CR8 inhibă CDK multiple, inclusiv CDK1, 2, 5, 7 și 9, nu este clar care CDK este responsabil pentru restaurarea de lungă durată a diferențierii epiteliale și reducerea lungimii cililor. Am întrebat dacă CDK5 joacă un rol esențial în reglarea acestor procese celulare. În primul rând, am efectuat experimente in vitro într-o linie de celule epiteliale renale jck imortalizată descrisă anterior (42) folosind inhibarea selectivă a CDK-urilor cu ARN interferent mic (siARN). A arătat în Figura 3, eliminarea CDK5 în celulele jck a dus la scurtarea semnificativă a lungimii ciliare, similar cu ceea ce s-a observat cu R-roscovitină. Dărâmarea CDK2 nu a avut acest efect (Fig. 3).