Abstract

Obiectiv

Scopul acestui studiu a fost de a analiza diferențele în compoziția fosfolipidică a monostratelor cu densitate foarte mică (VLDL), densitate scăzută (LDL) și lipoproteine ​​cu densitate înaltă (HDL) la femeile gravide slabe și obeze.

Metode

LDL, HDL și VLDL au fost izolate din probe de plasmă de 10 femei gravide slabe și 10 obeze, iar compoziția lor de specii de fosfatidilcoline (PC) și sfingomieline (SM) a fost analizată prin spectrometrie de masă tandem-cromatografie lichidă. Testul U Wilcoxon-Mann-Whitney și analiza componentelor principale (PCA) au fost utilizate pentru a investiga dacă profilurile de metaboliți diferă între grupul slab/obez și între speciile de lipoproteine.

Rezultate

Nu s-au găsit diferențe semnificative la nivelurile de metabolit între femeile însărcinate obeze și cele neobeze. Componentele PCA 1 și 2 s-au separat între LDL, HDL și VLDL, dar nu între greutatea normală și femeile obeze. Doisprezece SM și un PCae au fost mai abundente în LDL decât în ​​VLDL. În schimb, patru acil-alchil-PC și două diacil-PC au fost semnificativ mai mari în HDL comparativ cu LDL. VLDL și HDL au diferit în trei SM, șapte acil-alchil-PC și unul diacil-PC (valori mai mari în HDL) și 13 SM (mai mari în VLDL). De asemenea, am găsit asociații ale unor specii de fosfolipide cu colesterolul HDL și LDL.

Concluzie

La femeile gravide, compoziția fosfolipidelor diferă semnificativ în HDL, LDL și VLDL, similar cu constatările anterioare la bărbați și femei care nu sunt însărcinate. Femeile însărcinate obeze și slabe nu au prezentat diferențe semnificative în profilul lor de metabolit asociat lipoproteinelor.

Introducere

Obezitatea și comorbiditățile acesteia reprezintă o preocupare majoră pentru sănătatea publică [1]. S-a demonstrat că sarcina și viața timpurie pot stabili deja calea către o stare metabolică adversă ca și în cazul obezității. În acest sens, obezitatea maternă în timpul gestației este un factor de risc pentru obezitatea descendenților mai târziu în viață [2]. Din punct de vedere mecanic, lipoproteinele sunt una dintre principalele surse de aprovizionare cu nutrienți fetali, deoarece conțin triacilgliceroli (TG). Obezitatea este asociată cu un profil lipoproteic tulburat [3]. Prin urmare, nivelurile mai ridicate de lipoproteine ​​și o structură modificată a monostratului fosfolipidic sunt un obiect important de cercetare, deoarece modificările ar putea avea consecințe asupra aprovizionării cu energie a fătului și programarea timpurie a rezultatelor adverse negative asupra sănătății din cauza supra-aprovizionării sau a insuficienței de energie.

În starea de post, funcția lipoproteinelor cu densitate foarte mică (VLDL) este de a transporta acizii grași sub formă de TG de la ficat la țesuturile extrahepatice și, în timpul sarcinii, la făt pentru metabolismul energetic și întreținerea structurală [4]. Particulele VLDL sunt transformate în lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) care conțin mai puțin TG și mai mult colesterol decât VLDL. Colesterolul LDL poate fi preluat de țesutul mediat de receptorul LDL sau, la niveluri ridicate, poate fi depus în celulele scavenger în mediile intime ale vaselor de sânge, ceea ce contribuie la riscul bolilor cardiovasculare [5]. În schimb, HDL colectează colesterolul din țesuturile extrahepatice și îl transportă înapoi în ficat pentru excreția cu bilă, contribuind la reducerea riscului cardiovascular [6].

Acizii grași totali din plasmă sunt puternic asociați cu metabolismul lipoproteinelor și diverse caracteristici lipoproteice, precum colesterolul și conținutul speciilor saturate sunt legate de sănătatea cardiovasculară [7,8,9]. În ciuda dovezilor existente ale importanței compoziției acizilor grași lipoproteici pentru metabolismul și funcționalitatea unora dintre aceste particule [10], diferențele în speciile moleculare găsite în diferite lipoproteine ​​au fost greu studiate.

Suprafața tuturor lipoproteinelor este formată din fosfolipide, în principal fosfatidilcolină (PC) și sfingomielină (SM) [11]. Aceste două grupuri de fosfolipide au fost asociate pozitiv cu IMC mai mare în studiile clinice metabolomice direcționate [12,13,14,15]. Majoritatea studiilor metabolomice actuale utilizează plasma întreagă pentru analizele cu acizi grași din sânge și fosfolipide [16] și, de obicei, lipoproteinele diferite nu sunt separate înaintea analizei. Astfel, diferențele în compoziția lipoproteinelor nu sunt luate în considerare.

Diferențele în compoziția fosfolipidică a lipoproteinelor s-au arătat anterior la bărbați și femele care nu sunt însărcinate [17].

Am urmărit să caracterizăm compoziția fosfolipidică a LDL, HDL și VLDL la femeile însărcinate obeze și slabe, care, în afară de speciile de lipoproteine ​​din sarcină în general [18], nu a fost descrisă până acum în detaliu. Lipidele circulante se modifică considerabil în timpul sarcinii, iar nivelurile lipidelor au fost asociate cu antropometria descendenților [19]. Expresia placentară ridicată a lipazei endoteliale (EL), care scindează preferențial fosfolipidele, indică implicarea fosfolipidelor în transferul placentar al acizilor grași [20]. Astfel, o comparație a fosfolipidelor între lipoproteine ​​la femeile gravide poate îmbunătăți înțelegerea metabolismului lipidic în timpul sarcinii și susține planificarea unor studii metabolomice ulterioare cu privire la includerea analizelor specifice lipoproteinelor.

Materiale și metode

Subiecte

Douăzeci de femei însărcinate au fost studiate în momentul nașterii (între 37 și 41 de săptămâni de gestație) în Serviciul de obstetrică și ginecologie al Spitalului Clinic Virgen de la Arrixaca, Murcia (Spania), inclusiv 10 femei obeze (IMC înainte de sarcină> 30 kg/m 2) și 10 femei cu greutate normală (IMC înainte de sarcină 20-25 kg/m 2). Toate femeile au îndeplinit următoarele criterii de incluziune: sarcină unică, naștere la termen, vârstă 18-40 de ani, dietă omnivoră, nu au consumat suplimente DHA în ultimul trimestru, nefumători, scanare Doppler fetală normală și supusă unei cezariene elective. Subiecții care raportează probleme de sănătate sau complicații ale sarcinii au fost excluși. Consimțământul informat scris a fost obținut de la toți subiecții. Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică al spitalului.

Prelevarea de probe

Probele de sânge ale mamelor postite au fost colectate cu tuburi care conțin EDTA în momentul nașterii. Probele au fost centrifugate timp de 3 minute la 1200 g pentru a obține plasmă.

Analize biochimice

Insulina a fost analizată prin chemiluminiscență (DIAsource INSIRMA, Nivelles, Belgia) și glucoza, colesterolul total, TG, colesterolul LDL și colesterolul HDL au fost cuantificate printr-un analizator automat (Roche-Hitachi Modular PyD Autoanalyzer, Mannheim, Germania).

Izolarea lipoproteinelor

Lipoproteinele plasmatice materne au fost izolate din 1,5 ml de plasmă proaspătă prin ultracentrifugare folosind un gradient de densitate discontinuu NaCl/KBr [21] într-o ultracentifugă Optima L-100 XP echipată cu un rotor 100Ti (Beckman Coulter, CA, SUA). Restul plasmei a fost înghețat în azot lichid și depozitat la - 80 ° C până la analiză.

Măsurarea metabolomicii fosfolipidelor

Analiza metabolomică a fost efectuată la Divizia de Medicină Metabolică și Nutrițională a Dr. Spitalul de Copii von Hauner din München, Germania, prin cromatografie lichidă cuplată cu spectrometrie de masă tandem (LC-MS/MS), așa cum a fost descris anterior [12].

Analiza lipidelor polare a cuprins diacil-fosfatidilcoline (PCaa), acil-alchil-fosfatidilcoline (PCae) și SM. Tehnica analitică nu este capabilă să determine poziția legăturilor duble și distribuția atomilor de carbon între lanțurile laterale ale acizilor grași. Speciile de lipide sunt descrise folosind nomenclatura CX: Y, unde X este lungimea lanțului de carbon (C), Y este numărul de legături duble. „A” înseamnă că lanțul acil este legat printr-o legătură ester de coloana vertebrală și „e” înseamnă o legătură eterică.

Pentru toate analizele metabolomice, achiziția de date pe spectrometrul de masă, manipularea și cuantificarea datelor au fost efectuate cu software-ul Analyst 1.6.2 (AB Sciex, Darmstadt, Germania).

Control de calitate

Controlul calității (QC) pentru rezultate a fost efectuat prin utilizarea a șase probe QC pe lot. În general, două loturi au fost măsurate cu zece probe per specie de lipoproteine ​​și plasmă.

QC a fost bazat pe coeficientul de varianță (CV) între și intra-lot. Pentru CV-ul intra-lot, am folosit 20%, iar pentru CV-ul inter, am folosit 30% ca prag. Am exclus metaboliții dacă mai mult de o valoare a probelor QC a depășit 1,5 ori IQR. Acest lucru a fost făcut, deoarece cu 6 probe QC, 2 valori care depășesc 1,5 ori IQR pot fi întâmplătoare.

Statistici

Software-ul R (3.0.2) (R Project for Statistical Computing, http://www.r-project.org/) a fost utilizat pentru toate analizele statistice din acest studiu.

Am analizat grafic datele pentru o distribuție normală și anterioară. Valorile critice au fost definite ca valori care erau de 1,5 ori IQR peste sau sub mediana. Printre valorile critice, măsurătorile care erau două deviații standard în afară de valoarea următoare au fost declarate ca observații influente.

Valorile lipsă au fost imputate folosind k imputarea celui mai apropiat vecin (knn) [22], deoarece este necesar un set de date complet pentru calcularea procentelor. Dacă au mai rămas observații influente conform definiției de mai sus după imputarea knn, proba respectivă a fost exclusă. Am calculat procentele de metaboliți pentru fiecare individ și fiecare specie, pentru a descrie compoziția relativă a fosfolipidelor între lipoproteine. Procentele au fost calculate pe baza tuturor metaboliților și, de asemenea, metaboliților în funcție de grup (PCaa, SM, PCae). Într-un prim pas, am investigat diferențele în compoziția fosfolipidelor între femeile însărcinate slabe și obeze, stratificate în funcție de speciile de lipoproteine. A fost aplicat testul Wilcoxon Mann Whitney U, ca și pentru o dimensiune mică a eșantionului (\ (\ left (\ frac = \ kern0.5em 0.0007 \ right) \). Ori p-valorile sunt raportate, sunt corectate Bonferroni. Definim tendințele ca necorectate p-valori ale

Rezultate

Caracteristicile subiectului sunt prezentate în Tabelul 1. Un total de 71 PC și SM au trecut criteriile noastre de QC, cuprinzând 20 PCaa (11 specii poli-nesaturate), 27 SM (16 saturate și mono-nesaturate) și 24 PCae (15 polinesaturate). Testul Wilcoxon Mann Whitney U pentru diferențele în concentrațiile de metaboliți între greutatea normală și subiecții obezi nu au prezentat diferențe semnificative după corectarea Bonferroni în niciunul dintre subgrupurile de lipoproteine, în timp ce o tendință (necorectată) p-valoare Tabelul 1 Caracteristicile femeilor însărcinate

vldl

Complotul din Manhattan care arată | –log10 (p) | -valori (axa y) ale testului U Wilcoxon Mann Whitney, testarea diferențelor de metabolit în plasmă între greutatea normală și femeile însărcinate obeze, stratificate în funcție de speciile de lipoproteine. Linie împrăștiată: nivelul α necorectat la ± log10 (0,05) = ± 1,3

Analiza PCA a arătat o tendință discriminatorie între speciile de lipoproteine ​​pe baza componentelor principale (PrC) 1 și 2. Metaboliții cu cele mai mari scoruri în PrC 1 au constat în principal din specii SM, iar cei din PrC2 din speciile PC (Fig. 2, Tabel 2). Graficul scorului a arătat că PrC1 separă în principal LDL de celelalte două, HDL și VLDL, în timp ce PrC2 separă VLDL atât de LDL cât și de HDL. PCA confirmă că compoziția fosfolipidică a femeilor însărcinate obeze și slabe este similară.

Scorul grafic pentru analiza componentei principale a compoziției metabolitului lipoproteinelor la femeile gravide cu greutate normală și obeze

La testarea diferențelor dintre LDL și HDL la speciile cu un singur metabolit, LDL conținea în principal SM saturat și mononesaturat. SM C36: 1, SM C34: 1, SM C32: 1, SM C42: 3, SM C41: 1, SM C42: 2, SM C35: 1, SM C33: 1, SM C39: 1, SM C34: 2, SM C33: 3, SM C42: 1 și PCae C32: 1 s-au găsit semnificativ mai mari în LDL. Procentele de acizi grași polinesaturați (PUFA) care conțin PC, PCaa C38: 5, PCae C38: 5, PCae C36: 3, PCae C40: 6, PCae C44: 5 și PCaa C36: 4 au fost semnificativ mai mari în HDL decât în ​​LDL (Fig. 3).

În comparația dintre metaboliții din speciile VLDL și HDL, SM C42: 2, PCae C38: 5, SM C42: 1, PCae C42: 6, PCae C44: 5, PCae C38: 4, PCae C40: 6, PCae C36: 3, PCaa C32: 0, PCae C44: 6 și SM C41: 1 au fost semnificativ mai mari în HDL comparativ cu VLDL. Niciun metabolit nu a fost semnificativ mai mare în VLDL decât în ​​HDL (Fig. 3).

LDL a prezentat procente semnificativ mai mari de SM C42: 2, SM C36: 1, SM C41: 1, SM C34: 1, SM C42: 1, SM C34: 2, SM C41: 2, SM C36: 2, SM C33: 3, SM C42: 3, SM C32: 1, SM C33: 1 și SM C35: 1 comparativ cu VLDL (Fig. 3). În total, 25 (35%) din toate fosfolipidele măsurate au prezentat diferențe semnificative între speciile de lipoproteine.

Corelația Spearman dintre speciile de fosfolipide individuale și colesterolul HDL total și colesterolul LDL total a arătat asocieri cu diferite specii, în funcție de lipoproteină, dar diagramele de dispersie nu au prezentat tendințe clare (Fișier suplimentar 1: Figurile S1-S5). Topi metaboliți și asociații de colesterol în HDL, cu un coeficient de corelație> 0,3 au fost PCae C32: 1, PCae C36: 3, PCae C38: 5, PCaa C36: 4, SM C33: 3, SM C34: 2, SM C34: 1 și SM C32: 1. În LDL, asocierile de top dintre colesterol și fosfolipide au fost PCae C44: 5, PCaa C38: 5, SM C42: 3, SM C42: 1 și SM C32: 1 (Fișier suplimentar 1: Figurile S1-S5).

Discuţie

Compoziția fosfolipidică a lipoproteinelor din 10 femei gravide slabe și 10 obeze nu a fost semnificativ diferită între cele două grupuri.

Interesant este că compoziția speciilor fosfolipidice din principalele specii de lipoproteine, LDL, HDL și VLDL sunt similare cu datele raportate anterior pentru bărbați și femei care nu sunt însărcinate [17] (Tabelul 3).

De asemenea, am găsit SM mai mare în LDL decât VLDL sau HDL, în timp ce HDL a prezentat procente mai mari de PC, predominant PCae, decât celelalte două lipoproteine. Metaboliții asociați cu LDL conțin specii mai saturate și mono-nesaturate, în timp ce fosfolipidele găsite în proporții mai mari în HDL conțin mai multe specii polinesaturate. SM, în general, constă în principal din specii saturate și mononesaturate [24]. LDL este asociat cu specii mai saturate, iar raportul SM mai mare stabilit la PC este indicativ [25]. Acest studiu arată că nu numai saturația sau SM sunt asociate mai strâns cu LDL decât cu HDL, dar aceasta este, de asemenea, specifică speciilor SM.

Compoziția fosfolipidică a lipoproteinelor în ultimul trimestru de sarcină are o importanță deosebită, deoarece acest lucru se întâmplă atunci când transferul lipidic placentar se bazează în principal pe activitatea EL, care prezintă mai degrabă fosfolipază decât activitate lipază TG [26]. Prin urmare, conținutul speciilor de acizi grași polinesaturați și esențiali cu lanț lung este important pentru făt. Acestea se găsesc în principal în HDL [27], după cum sa confirmat în acest studiu. S-a demonstrat că SM are un efect inhibitor asupra EL, care este important în special pentru absorbția fosfolipidelor LDL, deși EL preferă HDL [28].

Arătăm rezultate similare la femeile însărcinate, comparativ cu femeile de sex masculin și cele care nu sunt însărcinate, în alte studii, care, de exemplu, au găsit LDL conținând mai mult SM C34: 1 decât VLDL sau HDL [17, 29]. Se pare că este posibil ca asocierea tiparelor de lipoproteine ​​cu bolile cardiovasculare și alte boli să se bazeze de fapt pe compoziția fosfolipidelor din diferite lipoproteine.

Concluzii

Am arătat pentru prima dată diferite distribuții de fosfolipide în lipoproteinele plasmatice ale femeilor însărcinate, asemănătoare cu cele ale bărbaților și ale femeilor care nu sunt însărcinate. Acest lucru indică faptul că funcționalitatea lipoproteinelor ar putea fi influențată de compoziția speciilor moleculare independent de starea sarcinii. Sunt necesare mai multe studii pentru a înțelege mai bine compoziția individuală a acizilor grași și a fosfolipidelor diferitelor lipoproteine ​​pentru a înțelege implicațiile acestora asupra metabolismului, sănătății și bolilor lipoproteinelor.