Etnofarmacologie

Editat de
George Q. Li

Universitatea Western Sydney, Australia

Revizuite de
Shuai Ji

Universitatea Medicală Xuzhou, China

Suresh K. Mohankumar

JSS College of Pharmacy, India

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontiere

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Medicină tradițională chineză, Spitalul Colegiului Medical din Uniunea Beijing, Colegiul Medical al Uniunii din Beijing, Academia Chineză de Științe Medicale, Beijing, China
  • 2 Centrul de Cercetări Medicale, Spitalul Colegiului Medical din Uniunea Beijing, Colegiul Medical al Uniunii din Beijing, Academia Chineză de Științe Medicale, Beijing, China

Decoctul Jin-Mai-Tong (JMT) este o rețetă tradițională chineză compusă pentru tratarea neuropatiei periferice diabetice (DPN). Scopul acestui studiu este de a investiga efectul neuroprotector al decoctului JMT asupra șobolanilor diabetici cu neuropatie periferică și de a elucida mecanismul potențial bazat pe o abordare metabolomică. Șobolanii Sprague-Dawley (SD) au fost împărțiți aleatoriu în patru grupuri: grupul martor, grupul model indus de Streptozotocin (STZ), grupul tratat cu doză mică JMT (JMT-L) și grupul tratat cu doză mare JMT (JMT-H). După 12 săptămâni de tratament, s-au estimat modificări de comportament, pierderi mici de fibre și leziuni histopatologice ale nervilor sciatici. Probele de ser au fost colectate pentru analize metabolomice nedestinate pe baza UPLC/QTOF-MS și statistici multivariate. Ca urmare, tratamentul cu JMT la două doze (13,9 și 27,8 g/kg⋅d) a îmbunătățit evident pragul mecanic al durerii (P 1. Numărul lotului și alte informații detaliate ale fiecărui material medicamentos au fost date în tabelul suplimentar S1 și în figura suplimentară S1. Specimenele de voucher au fost depuse la Departamentul de Medicină tradițională chineză, Spitalul Universitar Medical din Beijing Union, Beijing, China.

Pentru prepararea decoctului JMT, medicamentele brute amestecate au fost înmuiate cu apă liniștită la temperatura camerei (25 ° C) timp de 2 ore. Pentru primul decoct, medicamentele au fost refluxate cu 10 ori apă (1:10, w/v) timp de 1,5 ore înainte de filtrare. Pentru al doilea decoct, reziduurile de droguri au fost refluxate cu opt ori mai mare de apă (1: 8, w/v) înainte de filtrare. Cele două decocturi au fost apoi amestecate împreună și concentrate în vid. Decoctul concentrat a fost liofilizat cu un randament de extracție de 19%. Apoi, extractul JMT a fost depozitat la -80 ° C și bine suspendat în apă înainte de utilizare.

Analiza chimică a decoctului JMT

Animale și tratament

Șobolanii din grupul STZ + JMT-L și grupul STZ + JMT-H au fost administrați oral cu decoct JMT în doza de 13,9 g/kg (egală cu doza clinică, calculată în greutate a medicamentelor brute) și respectiv 27,8 g/kg, o dată pe zi și timp de 12 săptămâni consecutive după stabilirea modelului de diabet. Șobolanii din grupul STZ și grupul martor au fost administrați cu volum egal de apă distilată (5 ml) o dată pe zi. Greutatea corporală și nivelurile glicemiei de tip coadă la toți șobolanii au fost măsurate la fiecare 4 săptămâni.

Testarea senzorială Von Frey

După 12 săptămâni de tratament, sensibilitatea mecanică la stimulii nocivi a fost evaluată folosind un anestezimetru al instrumentului de măsurare a durerii Von Frey (IITC Life Science Inc., Woodland Hills, CA, Statele Unite) (Choi și colab., 2014; Yerra și colab., 2018). După cum s-a descris mai devreme, după ce șobolanii s-au adaptat la mediul înconjurător, laba posterioară a fost stimulată de o sondă a instrumentului Von Frey (Song și colab., 2019). Pragul mecanic al durerii a fost măsurat ca forță la care a fost observată retragerea labei și înregistrată în grame. Fiecare șobolan a fost măsurat de 3 ori pe labele bilaterale posterioare cu un interval de 5 minute între stimuli consecutivi. Pragul mecanic al durerii la șobolani a fost considerat drept măsurătorile medii.

Observarea modificărilor morfologice în nervul sciatic

La sfârșitul experimentului, toți șobolanii au fost sacrificați prin injecție intraperitoneală de 10% hidrat de clor (3 ml/kg) pentru anestezie profundă. După recoltarea sângelui, nervul sciatic stâng (2-3 mm) a fost izolat și fixat în paraformaldehidă (PFA) 4% la 4 ° C peste noapte. Nervul sciatic a fost încorporat în parafină și a tăiat atât secțiunea transversală, cât și secțiunea longitudinală (4 μm). Procedura histopatologică de rutină a fost efectuată pentru colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) pentru observarea modificărilor structurale patologice și imaginile au fost achiziționate de Aperio CS2 (Leica Biosystems, Richmond, IL, Statele Unite).

Profilul nervului intraepidermic și subepidermic

Pregătirea probei de ser

La sfârșitul experimentului, toți șobolanii au fost posti timp de 12 ore (gratuit pentru a bea apă) și apoi sacrificați pentru colectarea serului sub anestezie. Sângele a fost colectat din aorta abdominală. Fiecare probă a stat la 4 ° C timp de 4 ore, centrifugată la 3.000 rpm timp de 10 minute și supernatantul a fost colectat și depozitat la -80 ° C până la analiza metabolică. Înainte de analiză, fiecare probă de ser a fost decongelată la 4 ° C și o alicotă de 100 μL a fost transferată într-un tub siliconizat steril de 1,5 ml Eppendorf. După tratarea cu 300 μL de metanol rece, amestecul a fost agitat timp de 30 s și apoi a stat la 4 ° C timp de 1 oră pentru a precipita proteina. După centrifugare la 13.000 g timp de 10 min, supernatantul a fost apoi colectat și filtrat printr-o membrană de 0,22 μm înainte de analiza UPLC/Q-TOF MS. Eșantionul de control al calității (QC) a fost preparat prin amestecarea volumului egal (50 μL) din fiecare probă de testare. Eșantionul QC a fost injectat de 6 ori la începutul cursei pentru a asigura echilibrarea sistemului UPLC/Q-TOF MS și apoi între fiecare 6 eșantioane din cursă pentru a asigura coerența analizei.

Condiții UPLC/QTOF-MS

Prelucrarea datelor și analiza statistică

Preprocesiunea datelor brute și analiza multivariată pentru studiul metabolomicii au fost efectuate folosind MetaboAnalyst 4.0 2. După o procesare programată, matricile de date tridimensionale rezultate conțineau descrierea eșantionului, arii de vârf normalizate, iar perechile de timp de retenție-m/z au fost efectuate pentru analiza multivariată. Analiza componentelor principale (PCA) a fost utilizată pentru a afișa diferențele generale. Analiza parțială a discriminării cu cel mai mic pătrat (PLSDA) și proiecția ortogonală către analiza discriminării structurii latente (OPLS-DA) au fost utilizate pentru a verifica modelul și pentru a explora diferiții metaboliți între grupuri. Metaboliții selectați ca candidați pentru biomarkeri pentru analize statistice suplimentare au fost identificați pe baza importanței variabile în proiecție (VIP) ≥ 1 din modelul OPLS-DA validat încrucișat de 10 ori, care a fost validat la univariabil cu ajustare P 3 (Wishart și colab., 2018), baza de date KEGG 4 (Kanehisa și Goto, 2000) și METLIN (Sud și colab., 2007). Eroarea de masă a fost de 10 ppm pentru MS 1 și 15 ppm pentru MS 2. MetaboAnalyst 4.0 a fost utilizat pentru baza de analiză a căilor metabolice pe baza de date KEGG (Smith și colab., 2005).

Rezultate si discutii

Efectul decoctului JMT asupra glucozei din sânge, a pierderii în greutate corporală și a pragului de durere mecanică a șobolanilor DPN

Tratamentul cu decoctoină JMT, atât la doze mari, cât și la doze mici, nu a afectat greutatea corporală a șobolanilor diabetici induși de STZ (Figura 1A, P > 0,05). După cum se arată în Figura 1B, după tratamentul de 12 săptămâni, șobolanii diabetici tratați cu decoct JMT în doză mare au prezentat un nivel mai scăzut de glucoză în sânge decât șobolanii diabetici netratați (P 0,05). Scăderea ușoară a glicemiei indicând un potențial efect hipoglicemiant al decoctului JMT. Cu toate acestea, reglarea metabolismului glucozei a fost marginală, deoarece nivelul de glucoză din sânge al șobolanului diabetic tratat cu JMT-H a fost mult mai mare decât șobolanul normal sănătos. În plus, modelul animal utilizat în acest studiu a fost modelul de șobolan diabetic de tip 1 indus prin injecție STZ, care se află în deficit absolut de insulină, astfel încât efectul potențial hipoglicemiant al decoctului JMT observat aici s-ar putea să nu fie insuficient pentru a-și demonstra semnificația clinică. Pentru a explora în continuare efectul hipoglicemiant al decoctului JMT și a obține mai multe dovezi pentru practicile clinice, vor fi luate mai multe experimente pe modelul animal diabetic de tip 2 și prin recrutarea pacienților diabetici în viitorul apropiat.

figura 1. Efecte: 1 buc de JMT asupra greutății corporale (A), glucoza din sange (B), și testarea senzorială Von Frey (C). Datele sunt medii de grup ± SEM (n = 6 per grup). ## P 0,05).

Decoctul JMT a îmbunătățit modificările patomorfologice ale nervului sciatic la șobolanii DPN

Figura 2. Examinarea histologică a nervului sciatic în secțiunea transversală (ANUNȚ) și longitudinal (E - H) vedere. Fibrele mielinizate normale ale nervilor sciatici au fost aranjate într-un mediu dens și înfășurate cu mielină (săgeți galbene). Nervii sciatici ai șobolanilor DPN au prezentat defecte evidente de tip vacuolar (săgeți albastre), modificări de demielinizare și contracție axonală (săgeți verzi). Mărire: 40 ×, bare de scară: 20μm (secțiune transversală) și 50μm (secțiune longitudinală).

Figura 3. Profilurile nervoase ale pielii piciorului detectate prin testul imunofluorescenței. (ANUNȚ) Imagini reprezentative ale colorării imunofluorescente a nervilor pielii plantare labei posterioare. Săgețile galbene indică fibra nervoasă intraepidermică imunoreactivă PGP 9,5 (IENF) și săgețile roșii indică fibra nervului subepidermic (SNF). Mărire: 20 ×, bare de scară: 100 μm; (E) SNFD (fibre/mm); (F) IENFD (fibre/mm). Datele sunt medii de grup ± SEM (n = 3 pe grup). *P # P ## P 0,05).

Analiza metabolomice

Asigurarea calității

Pentru a evalua repetabilitatea metodei stabilite, cinci ioni extrasați în modul ion pozitiv (0.73_407.9660, 4.16_503.2578, 8.54_255.2217, 12.11_889.9594 și 16.20_743.5491, au arătat sub formă de timp de reținere_m/z) și cinci ioni extrasați în modul de ioni negativi (0,55_143,0938, 4,76_671.2985, 8,53_301,2971, 12,75_629.8071 și 16,89_955.4596) au fost selectați din probele de control al calității (QC) din întreaga experiment. S-a evaluat precizia zonei de vârf a celor zece ioni. Așa cum se arată în Tabelul suplimentar S3, RSD-urile zonei de vârf ale celor 10 ioni selectați au fost de 2,53-11,29%, indicând o bună precizie a sistemului UPLC/QTOF-MS. În plus, analiza corelației probelor QC a arătat, de asemenea, o stabilitate satisfăcătoare a sistemului cu R 2 ≥ 0,977 și 0,963 în mod pozitiv și respectiv negativ (Figura suplimentară S3). Rezultatul a indicat faptul că abordarea metabolomică a fost repetabilă și stabilă pentru următoarele cercetări.

Analiza statistică multivariată

Figura 4. Discriminarea profilului metabolic al serului la șobolani Control (CON), STZ, STZ + JMT-H, STZ + JMT-L. (A1, A2) Punctajele grafice ale PCA în moduri de ioni negativ și respectiv pozitiv. (B1, B2) Punctajele grafice ale PLS-DA în moduri de ioni negativ și respectiv pozitiv, n = 6 per grup.

Ecranul și identificarea biomarkerilor potențiali

Analiza discriminantă ortogonală a celor mai mici pătrate (OPLS-DA) a fost efectuată pentru a identifica ionii semnificativ modificați între grupurile martor și STZ, grupurile STZ și STZ + JMT-H, precum și grupurile STZ și STZ + JMT-L. Modelele OPLS-DA au fost dezvoltate pe baza diferențelor maximizate intergrup și a diferențelor intragrup minimizate și au arătat abilități acceptabile pentru predicție și fiabilitate cu R 2 Y ≥ 0,89 și Î 2 ≥ 0,44 (Figura 5). Apoi, a fost generată importanța variabilă în proiecția (VIP). În acest studiu, ion variabil cu valoare VIP> 1 și P 1 în OPLS-DA și P Cuvinte cheie: neuropatie periferică diabetică, Medicină tradițională chineză, decoct Jin-Mai-Tong, metabolomică, diabet

Citare: Zhang Q, Song W, Liang X, Xie J, Shi Y, Shi X, Qiu B și Chen X (2020) O perspectivă metabolică asupra efectului neuroprotector al decoctului Jin-Mai-Tong (JMT) asupra șobolanilor diabetici cu periferic Neuropatie folosind strategia de metabolizare neintenționată. Față. Farmacol. 11: 221. doi: 10.3389/fphar.2020.00221

Primit: 18 noiembrie 2019; Acceptat: 18 februarie 2020;
Publicat: 05 martie 2020.

George Qian Li, Universitatea Western Sydney, Australia

Shuai Ji, Universitatea de Medicină Xuzhou, China
Suresh Kumar Mohankumar, JSS College of Pharmacy, India

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare