Fiziologie integrativă

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Progrese în mecanismele metabolice de îmbătrânire și bolile asociate Vezi toate cele 11 articole

Editat de
KATIA AQUILANO

Universitatea din Roma Tor Vergata, Italia

Revizuite de
Everardo M. Carneiro

Universitatea de Stat Campinas, Brazilia

Márcia Q. Latorraca

Universitatea Federală din Mato Grosso, Brazilia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

catabolic

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Fiziopatologie, Institutul Internațional de Medicină Hongqiao, Spitalul Tongren, Laboratorul cheie de diferențiere celulară și apoptoză al Ministerului chinez al Educației, Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai, China
  • 2 Departamentul de Cardiologie, Spitalul Xijing, Universitatea a patra medicală medicală, Xi’an, China
  • 3 Școala de Medicină, Universitatea Shanghai Jiao Tong, Shanghai, China
  • 4 departamente de anestezie, medicină și fiziologie, Școala de medicină David Geffen de la Universitatea din California, Los Angeles, Los Angeles, CA, Statele Unite

Introducere

În ultimii ani, rezistența la insulină și diabetul au fost legate de homeostazia perturbată a aminoacizilor cu lanț ramificat (BCAA) la animalele obeze și la oameni (Lynch și Adams, 2014). BCAA, inclusiv leucina, izoleucina și valina, sunt aminoacizi esențiali. O serie de studii observaționale au constatat că nivelurile circulante crescute de BCAA sunt asociate cu diabetul zaharat de tip 2 (T2DM) și rezistența la insulină la om și unele modele de rozătoare (Shaham și colab., 2008; Huffman și colab., 2009; Tai și colab., 2010; Xu și colab., 2013; Lynch și Adams, 2014; Lian și colab., 2015). Studiile longitudinale și prospective efectuate în diferite cohorte au raportat că nivelul crescut de BCAA în sânge este predictiv pentru patogeneza diabetului și modificarea nivelului plasmatic de BCAA este prognostic pentru rezultatele intervenției diabetului (Wang și colab., 2011; Melnik, 2012; Wang-Sattler și colab. ., 2012; Floegel și colab., 2013; Lu și colab., 2013; McCormack și colab., 2013). Nivelurile mai mici de BCAA au fost asociate cu o rezistență îmbunătățită la insulină după proceduri intervenționale (Laferrere și colab., 2011; Wang și colab., 2011; Shah și colab., 2012). Asocierea clară a condus la speculațiile cu privire la un potențial rol cauzal al homeostaziei BCAA perturbate în T2DM (Lynch și Adams, 2014).

Homeostazia aminoacizilor cu lanț ramificat este determinată în mare măsură de activitățile lor catabolice în țesuturi. Primii doi pași ai catabolismului BCAA sunt împărtășiți de toți cei trei BCAA. Pasul inițial de dezaminare pentru a produce cetoacizi cu lanț ramificat (BCKA) este catalizat de transaminaza BCAA (BCAT), care este urmată de decarboxilarea oxidativă pentru a forma esteri CoA, o reacție catalizată de complexul BCKA dehidrogenază (BCKD). Complexul BCKD este enzima care limitează viteza pentru catabolismul BCAA și este strict reglementată prin fosforilarea inhibitoare prin BCKDK și activarea defosforilării prin fosfataza mitocondrială 2C (PP2Cm). Pierderea PP2Cm în modelul genetic afectează parțial catabolismul BCAA, ducând la concentrații mai mari de BCAA și BCKA plasmatice (Lu și colab., 2009). În mod similar, la animalele obeze și la oameni, genele catabolice BCAA sunt reglementate în jos și catabolismul BCAA este moderat defect, contribuind la creșterea BCAA plasmatice și BCKA (She și colab., 2007b, 2013; Pietiläinen și colab., 2008; Herman și colab. al., 2010; Lackey și colab., 2013; Lu și colab., 2013; Menni și colab., 2013; Zimmerman și colab., 2013).

Asocierea puternică dintre nivelul crescut de BCAA și T2DM asociat cu obezitatea indică faptul că homeostazia BCAA perturbată poate contribui la controlul glicemic disfuncțional. Într-adevăr, studii recente arată că defectul catabolic al BCAA contribuie la rezistența la insulină și diabetul zaharat (White și colab., 2018; Zhou și colab., 2019). Cu toate acestea, la animalele obeze și la oameni, metabolismul lipidic neregulat și alte procese afectează dramatic sensibilitatea la insulină și metabolismul glucozei. Astfel, rămâne o provocare să deosebim impactul curat al defectului catabolic BCAA asupra metabolismului glucozei de perturbarea obezității la animalele obeze. Folosind șoareci slabi, studiul actual investighează impactul defectului catabolic BCAA asupra proceselor metabolice ale glucozei într-un model genetic de șoarece în care PP2Cm este ablat pentru a afecta parțial catabolismul BCAA.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii de sex masculin de tip C57BL/6 și PP2Cm knockout, de vârstă potrivită vârstei, au fost pe același fond genetic și au fost menținuți în aceeași instalație. Șoarecii knock-out PP2Cm au fost generați așa cum s-a descris anterior (Lu și colab., 2009). Toate animalele (la vârsta de 10-14 săptămâni) au fost adăpostite la 22 ° C cu un ciclu întunecat de 12 ore de lumină, 12 ore cu acces gratuit la apă și chow standard. Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare și protocoalele aprobate de Comitetul pentru Tratamentul Uman al Animalelor de la Școala de Medicină a Universității Shanghai Jiao Tong sau de la Universitatea din California din Los Angeles Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor.

Măsurători de calorimetrie indirectă

Măsurătorile consumului de oxigen (VO2) și producției de dioxid de carbon (VCO2) cu calorimetrie indirectă au fost efectuate la temperatura ambiantă utilizând un sistem de monitorizare a animalelor de laborator (CLAMS, Columbus Instruments, OH, Statele Unite), conform instrucțiunilor producătorului. Raportul de schimb respirator (RER) este egal cu [volumele de CO2 eliberate]/[volumele de O2 consumate]. Șoarecii masculi au fost admiși într-o CLAMS cu acces gratuit la alimente și apă și li s-a permis să se aclimatizeze în cuști metabolice individuale timp de 48 de ore înainte de orice măsurare și datele au fost colectate în următoarele 36 de ore.

Test de toleranță la glucoză și insulină

Șoarecii de sex masculin au fost postiti 6 ore începând cu ora 8 dimineața. Pentru testul de toleranță la insulină, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu insulină (0,75 U/kg greutate corporală; Sigma, Statele Unite). Pentru testul de toleranță la glucoză, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu D-glucoză (1,5 g/kg greutate corporală; Sigma, Statele Unite). Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate folosind un glucometru portabil (Johnson & Johnson, Statele Unite) prin sângerarea cozii la orele indicate după injectare.

Izolarea ARN și qRT-PCR

ARN-ul total a fost extras din țesuturi sau celule folosind Trizol (Invitrogen, Statele Unite). ARN total (2 μg) a fost transcris invers folosind primeri aleatori și MMLV (Promega, Statele Unite). Fiecare probă de ADNc a fost analizată cu sistemul PCR în timp real Applied Biosystems Prism7900HT folosind Absolute SYBR Green (ABI, Statele Unite) cu următoarele secvențe de primeri:

mouse PYGL_R: 5′CTTGACCAGAGTGAAGTGCAG 3 ′.

Analiza metabolomică

Cultură de celule

Celulele HepG2 au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (Hyclone, Beijing) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS, Sigma), penicilină (100 UI/ml) și streptomicină (100 μg/ml) într-un 5% CO2 umidificat % incubator de aer la 37 ° C. Pentru stimularea prin BCAA (800 μM) sau BCKA (400 μM), celulele au fost incubate în DMEM fără ser timp de 12 ore, apoi incubate în DMEM fără BCAA timp de 1 oră înainte de inițierea tratamentelor de 12 ore. BCAA și BCKA au fost diluate în DMEM fără BCAA. DMEM personalizat fără BCAA a fost furnizat de Invitrogen. Produsele chimice BCAA și BCKA au fost achiziționate de la Sigma.

Analiza mitocondrială

Izolarea mitocondriilor pentru a măsura consumul de oxigen a fost efectuată așa cum s-a descris în altă parte (Korge și colab., 2011). Pe scurt, mitocondriile au fost izolate din țesuturi și consumul de oxigen a fost măsurat folosind un spectrofluorometru cu fibră optică Ocean Optics. S-au adăugat mitocondrii (0,25 mg/ml) la tamponul de testare (125 mM KCl, 10 mm HEPES-KOH, pH 7,4). Concentrația de oxigen din tampon a fost înregistrată continuu printr-un senzor de oxigen din fibra optică Ocean Optics FOXY. S-au adăugat piruvat, malat și glutamat sub formă de acizi liberi tamponați cu Tris (pH 7,4) pentru testarea activității complexului I. Succinat a fost utilizat pentru testarea activității Complex II în prezența rotenonei (1 μM). Adăugarea de 0,2 mM ADP a inițiat consumul de oxigen. Amestecul de NaCI sau BCKA-Na a fost adăugat la sistemul de reacție după ce a fost consumat primul impuls de ADP. Apoi a fost adăugat al doilea impuls al ADP. Rata consumului de oxigen (OCR) a fost calculată cu fiecare adăugare ADP. Rata relativă a consumului de oxigen a fost calculată prin împărțirea OCR al celui de-al doilea impuls al ADP la OCR al primului impuls al ADP. Datele prezentate au reprezentat valorile medii ale trei experimente independente.

Statistici

Cu excepția cazului în care se specifică altfel, analizele statistice au fost efectuate cu studenții cu două fețe t-test sau ANOVA cu două căi, urmat de un Bonferroni post hoc test (teste de toleranță), după caz, utilizând GraphPad Prism. Datele au fost calculate ca medie ± SEM. A p-valoarea mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

Rezultate

Caracterizarea fiziologică a șoarecilor slabi cu defect catabolic BCAA

figura 1. Defectul catabolic al aminoacizilor cu lanț ramificat (BCAA) reduce greutatea corporală cu efecte benefice asupra metabolismului glucozei la șoarecii PP2Cm KO. Greutate corporala (A, n = 10-11), aport alimentarB, n = 10-11), raporturi de schimb respirator (RER)C, n = 9/genotip), RER mediu în timpul ciclurilor de lumină și întunericD, n = 9/genotip), test de toleranță la glucoză (DE EXEMPLU) și testul de toleranță la insulină (F, H) de șoareci masculi WT și PP2Cm KO hrăniți cu o dietă normală (n = 8 pentru fiecare grup). Datele sunt reprezentate ca mijloace ± SEM. ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ P ∗ p ∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗ p Cuvinte cheie: aminoacizi cu lanț ramificat, metabolismul glucozei, defect catabolic, șoareci slabi, ficat

Citație: Wang J, Liu Y, Lian K, Shentu X, Fang J, Shao J, Chen M, Wang Y, Zhou M și Sun H (2019) BCAA Defectul catabolic modifică metabolismul glucozei la șoarecii slabi. Față. Fiziol. 10: 1140. doi: 10.3389/fphys.2019.01140

Primit: 07 iunie 2019; Acceptat: 20 august 2019;
Publicat: 04 septembrie 2019.

Katia Aquilano, Universitatea din Roma Tor Vergata, Italia

Márcia Queiroz Latorraca, Universitatea Federală din Mato Grosso, Brazilia
Everardo Magalhaes Carneiro, Universitatea de Stat din Campinas, Brazilia

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare