• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: yelihong @ nankai.edu.cnzhangxd @ nankai.edu.cn

Abstract

Introducere

Celulele canceroase se caracterizează prin dobândirea mai multor caracteristici care le permit să devină tumorigenice, în care proliferarea necontrolată este una dintre cele mai fundamentale caracteristici ale celulelor canceroase (1, 2). Activarea oncogenelor și efectele lor de cooperare joacă un rol crucial în procesul de tumorigeneză și proliferare celulară. Reprogramarea mediată de oncogen a expresiei genelor, care permite celulei să dobândească tulburări metabolice, ciclul celular și alte aspecte, este un semn distinctiv al celulelor canceroase (1, 3, 4). Foarte important, proto-oncogena c-Myc, care a fost implicată în patogeneza majorității tipurilor de tumori umane (1, 5), afectează mai multe procese biologice celulare, inclusiv ciclul celular, sinteza proteinelor, aderența celulară, citoscheletul, metabolismul și reglarea miARN (6-8). Proteina c-Myc se leagă de o secvență de ADN numită cutie E (CACGTG) și se dimerizează cu Max pentru a media, abordând un total de 3.000 până la 4.000 de gene umane (9, 10). Proteina c-Myc conține un domeniu de legare de ADN de bază și un motiv de dimerizare cu fermoar helix-loop-helix-leucina (HLH-Zip), prin care ceilalți factori de transcripție și coactivatori pot afecta expresia genelor țintă c-Myc (11, 12). Cu toate acestea, mecanismul de bază al reglării transcripționale a genelor țintă c-Myc rămâne un mister nerezolvat.

hbxip

Proteina cu interacțiune X a hepatitei B de mamifere (HBXIP), cunoscută și sub numele de LAMTOR5 (13), este o proteină de 18 kDa care conține un fermoar de leucină la C-terminal și secvența sa este bine conservată în rândul speciilor de mamifere (14). Am raportat că expresia HBXIP este în mod evident îmbogățită în țesuturile cancerului de sân. HBXIP acționează ca un coactivator transcripțional oncogen al mai multor factori de transcripție, cum ar fi TF-IID, STAT3, SP1, CREB și E2F1, în promovarea creșterii cancerului de sân și a metastazelor (15-20). Cu toate acestea, dacă HBXIP servește ca un coactivator al factorului transcripțional oncogen c-Myc în cancerul de sân rămâne puțin înțeles.

Având în vedere că activarea transcripțională este legată de mediul cromatinei, modificarea histonei H3 este modelul major al remodelării cromatinei (21). Demetilaza 1 lizin-specifică (LSD1), demetilarea medie a H3K4 duce la oxidarea ADN-ului local ca forță motrice în ansamblul complexului de inițiere a transcripției indus de c-Myc (22, 23). Epigenetica este implicată în transcripția mediată de c-Myc (24, 25). ARN-urile lungi necodificate (lncRNA) apar ca noi jucători în paradigma cancerului, demonstrând roluri potențiale atât în ​​căile oncogene, cât și în căile supresoare tumorale. Aceste gene noi îndeplinesc funcții biologice remarcabile într-o varietate de tipuri de cancer uman (26). LncRNA HOX transcript antisens ARN intergenic (Hotair), identificat ca un 2,2 kilobază ncRNA care locuiește în locusul HOXC, se poate lega de LSD1. Hotair servește ca un schelă de complexe de modificare a histonelor cuprinzând LSD1 și complexul policomborepresiv 2 (PRC2), rezultând malignitatea tumorilor multiple (27, 28). S-a raportat că lncRNA PRNCR1 și PCGEM1 sunt implicate în complexul transcripțional androgen-receptor (29). Cu toate acestea, dacă Hotair este implicat în activarea transcripției indusă de c-Myc nu este bine documentat.

În acest studiu, încercăm să obținem informații despre mecanismul activării transcripției mediate de c-Myc. Interesant este faptul că datele noastre arată că HBXIP acționând ca un coactivator interacționează direct cu factorul de transcripție c-Myc. HBXIP și LSD1 formează un complex care este schelat de Hotair pentru a activa c-Myc în promotorul genelor țintă c-Myc, ducând la activarea transcripției genelor țintă c-Myc în celulele cancerului de sân. Astfel, descoperirea noastră oferă noi perspective asupra mecanismului prin care c-Myc funcționează în carcinogeneză.

Materiale și metode

Liniile celulare, transfecția și ARNsi

Linia celulară de sân imortalizată HBL-100 și linia celulară de cancer de sân MCF-7, T47D, LM-MCF-7 și SK-BR3 au fost cultivate în mediu RPMI 1640 (Invitrogen) cu 10% FCS. Celulele MDA-MB-463, MDA-MB-231 și HEK293T au fost cultivate în DMEM (Invitrogen) suplimentat cu 10% FCS. ARNsi care vizează ARNm HBXIP au fost raportate anterior (16, 19). ARNsi care vizează ARNm c-Myc, Hotair și ARNm LSD1 au fost enumerate în Tabelul suplimentar S1 (28). Celulele au fost transfectate cu plasmide sau siRNA corespunzătoare utilizând Lipofectamina 2000 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului.

Testele de imunoprecipitare a cromatinei și suprapunerea legării HBXIP și c-Myc

Testele de imunoprecipitare a cromatinei (ChIP) au fost efectuate folosind trusa EpiQuik de imunoprecipitare a cromatinei de la Epigentek Group Inc. Celulele MCF-7 au fost lizate la 24 de ore după transfecție. Complexele proteine ​​/ ADN au fost imunoprecipitate de anticorpi HBXIP sau LSD1, folosind IgG normal de iepure ca martor negativ. Primerii utilizați pentru amplificarea PCR au flancat cutia E în promotorii ciclinei A, eIF4E și LDHA (30-32). Selecția și legarea ChIP-ADN (ChIP-DSL) și analiza datelor genelor legate de HBXIP au fost efectuate de CapitalBio Corporation conform unui protocol de la Aviva Systems Biology. Experimentele au fost repetate de trei ori, iar rezultatele au fost analizate folosind MAS (http://bioinfo.capitalbio.com/mas/login.do) cu o valoare P de 1,0 × 106 pentru identificarea promotorului. Conform raportului anterior (33), seturile de date ale ChIP-seq pentru c-Myc au fost utilizate. Conform numărului de aderare și denumirii genei, au fost utilizate 1.348 de gene legate în top în seturile de date c-Myc pentru a fuziona cu genele legate de HBXIP pentru suprapunere. Căile genetice au fost analizate utilizând baza de date KEGG a DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/).

Colorare imunohistochimică

Microarraysurile de țesut pentru cancerul de sân au fost achiziționate de la Xi'an Aomei Biotechnology. Colorarea IHC a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (16). Controlul negativ a fost efectuat conform protocolului de mai sus fără a utiliza anticorp primar. Nivelul de colorare a HBXIP, ciclinei A, eIF4E și LDHA a fost clasificat în trei grupuri utilizând o metodă de notare modificată bazată pe intensitatea colorării (0, negativ; 1, scăzut; 2, ridicat) și procentul de celule colorate (0, 0% colorat; 1, 1% –49% colorat; 2, 50% –100% colorat). Un scor multiplicat (scor intensitate × scor procentual) mai mic de 1 a fost considerat a fi colorare negativă (-), 1 și 2 au fost considerate a fi colorare moderată (+), iar 4 a fost considerat a fi colorare intensă (++).

Analiza PCR în timp real și Western blot

Un total de 40 de cazuri de țesuturi de cancer mamar au fost colectate de la pacienții supuși rezecției cancerului mamar la spitalul Tianjin First Center (Tianjin, China). ARN-urile totale din țesuturile sau celulele cancerului de sân au fost extrase folosind reactivul TRIzol (Invitrogen) conform instrucțiunilor (16). ADNc din prima catenă a fost sintetizat prin transcriptază inversă PrimeScript (TaKaRa Bio) conform instrucțiunilor producătorului. Grundele utilizate pentru a testa expresia HBXIP au fost obținute din rapoarte (16). PCR în timp real a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (16). Exemplele utilizate în studiu au fost enumerate în tabelul suplimentar S2. Pentru analiza Western blot (16), lizatul proteic total a fost extras din țesuturi sau celule cu tampon RIPA (Solarbio). Probele de proteine ​​au fost supuse SDS-PAGE și apoi transferate la o membrană de nitroceluloză, blocate cu lapte negrăsit 5% și incubate cu anticorpi primari timp de 2 ore la temperatura camerei. După incubare cu anticorp secundar timp de 1 oră, membrana a fost vizualizată de ECL (Millipore). Anticorpii utilizați în acest studiu au fost enumerați în tabelul suplimentar S3. Toate experimentele au fost repetate de 3 ori.

Constructii

Plasmidele, cum ar fi pCMV-Tag2B, pCMV-HBXIP, pcDNA3.1, pcDNA-HBXIP, pGEX-4T1, pGEX-HBXIP și pCMV-HBXIP-LZM, au fost utilizate în studiile noastre anterioare (16, 34, 35). Reporterul E-box a fost construit prin inserarea 6 × E-box în vectorul pGL3-Basic (36). Vectorul pcDNA-Hotair cu Hotair de lungime completă a fost construit de Genomics. HBXIP uman, c-Myc și fragmentele de HBXIP au fost amplificate prin PCR din ADNc al ARN-urilor totale din celulele MCF-7. Produsele rezultate au fost donate în siturile multiple de donare ale vectorilor, cum ar fi pEGFP-C2, pCMV-Tag2B, pET28, pcDNA3.1, pcDNA-HA și, respectiv, pGEX-4T1.

Testele genei reporterului luciferazei

Plasmidele vectorului reporter pRL-TK de Renilla luciferază au fost utilizate așa cum s-a descris anterior (16). Activitățile luciferazei au fost normalizate la activitatea luciferazei Renilla. Toate testele au fost efectuate în trei exemplare. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri și cultivate timp de 24 de ore înainte de transfecție. Activitățile de luciferază ale reporterului E-box și ale reporterului Gal4-c-Myc au fost determinate la 36 de ore după transfecție utilizând un kit de testare a genei cu reporter dual-luciferază (Promega).

Colorare imunofluorescentă și microscopie confocală

Colorarea prin imunofluorescență a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (35). După transfecție, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă și permeabilizate cu 0,1% Triton X-100 în PBS. După blocarea în PBS conținând 3% BSA, celulele au fost incubate cu anticorpi primari la temperatura camerei. După spălare cu PBS, celulele au fost incubate cu anticorp secundar conjugat cu fluorofor (DAKO) și DAPI. După spălare cu PBS, lamele au fost montate cu glicerol și observate la microscopie confocală (Leica TCS SP5).

Testul de coimmunoprecipitare și extragerea GST

Celulele au fost recoltate și lizate într-un tampon de liză (50 mmol/L Tris-HCI, pH 8,0, 100 mmol/L NaCI, 50 mmol/L fluorură de sodiu, 1% Nonidet P-40, 1 mmol/L ditiotreitol, 1 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L Microcistină-LR, 1 mmol/L fluorură de fenilmetilsulfonil, 10 mg/ml leupeptină și 10 mg/ml aprotinină). Lizatele au fost incubate cu anticorpi/mărgele de agaroză conjugate cu proteina G (Millipore) sau mărgele de gel de afinitate AN2-FLAG M2 (Sigma). Precipitatele au fost spălate de șase ori cu tampon de liză rece cu gheață, resuspendat în PBS, urmat de analiza Western blot. Derularea GST a fost efectuată conform protocoalelor publicate (16). Margelele de glutation au fost recuperate printr-o scurtă centrifugare și spălate de șase ori cu tampon de liză, urmate de analiza Western blot.

Testele de schimbare a mobilității electroforezei

Protocolul de analiză a mobilității electroforezei (EMSA) a fost descris în detaliu (16, 17). Extractele nucleare au fost preparate cu celule MCF-7 folosind trusa de extracție nucleară EpiQuik (Epigentek). Sondele au fost generate prin recoacerea oligonucleotidelor monocatenare care conțin cutia E (37). Anticorpul primar (1 μg) a fost incubat cu extracte nucleare pe gheață înainte ca sondele să fie adăugate în tamponul de legare. Probele au fost incubate pe gheață și apoi separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă fără denaturare, apoi gelul a fost uscat și supus autoradiografiei.

Testele de imunoprecipitare a ARN-ului

Testele de imunoprecipitare ARN (RIP) au fost efectuate în condiții native așa cum este descris (29). Pe scurt, nucleii celulelor MCF-7 au fost peletați și lizați. Lizatele au fost trecute printr-un ac de calibru 27,5 de 4 ori pentru a promova liza nucleară. Supernatantul a fost incubat cu 4 μg anticorp primar anti-HBXIP de iepure sau anti-c-Myc de șoarece (Tabelul suplimentar S3) cu 40 μL de mărgele de agaroză conjugate G (Millipore) sau margele de gel de afinitate ANTI-FLAG M2 (sigma) Complexul ARN/anticorp a fost spălat cu tampon NT2 (50 mmol/L Tris-HCI, pH 7,4, 150 mmol/L NaCI, 1 mmol/L MgCl2, 0,05% NP-40). ARN-ul a fost extras de TRIzol (Invitrogen) conform protocolului producătorului și supus analizei PCR în timp real.

Testele MTT

Testele de creștere celulară au fost efectuate utilizând reactiv MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-dif-eniltiltrazolium) (Sigma), așa cum s-a descris anterior (38). Pe scurt, celulele transfectate au fost tripsinizate, numărate și placate în plăci cu 96 de godeuri. După incubarea diferitelor perioade de timp, MTT a fost adăugat direct la fiecare godeu, urmat de incubare timp de 4 ore și apoi supernatantul a fost îndepărtat și s-au adăugat 100 μL de dimetil sulfoxid pentru a opri reacția. Absorbanta la 490 nm a fost masurata folosind un sistem de citire ELISA (Labsystem, Multiskan Ascent). Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare.

Transplantul de animale

Toate procedurile experimentale care implică animale au fost în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (publicațiile NIH nr. 80-23, revizuite în 1996) și au fost efectuate în conformitate cu ghidurile etice instituționale pentru experimentul pe animale. Celulele MCF-7 (1 × 10 7) transfectate tranzitoriu cu plasmide și siRNA corespunzătoare au fost injectate subcutanat în flancurile șoarecilor nudi atimici BALB/c masculi de 4 săptămâni, respectiv. Creșterea tumorii a fost monitorizată la fiecare 4 zile. După 26 de zile, șoarecii au fost sacrificați, au fost efectuate necropsii și tumorile au fost cântărite. Volumul tumorii (V) a fost monitorizat prin măsurarea lungimii (L) și lățimii (W) folosind etriere și calculat conform formulei (L × W 2) × 0,5 (16).

analize statistice

Fiecare experiment a fost repetat de cel puțin trei ori. Semnificația statistică a fost evaluată prin compararea valorilor medii (± SD) folosind testul Student t pentru grupuri independente, presupus pentru testul P 2 sau testul Kruskal - Wallis utilizând programul software SPSS (SPSS).