Editat de Bruce S. McEwen, Universitatea Rockefeller, New York, NY și aprobat pe 4 noiembrie 2015 (primit pentru examinare 14 august 2015)

exogen

Semnificaţie

Capacitatea compromisă a neuronilor de a exprima proteina de șoc termic 70 (Hsp70) se corelează cu neurodegenerarea legată de îmbătrânire. În acest studiu, șoarecii de vârstă mijlocie și bătrâni au fost tratați cronic până la moarte cu Hsp70 uman administrat intranazal și au fost investigați după 5 sau 9 luni de tratament cu Hsp70 pentru capacitatea lor cognitivă și densitatea sinaptică. Tratamentul cu Hsp70 a extins durata medie și maximă de viață, învățarea și memoria îmbunătățite la animalele vechi, a crescut curiozitatea, a scăzut anxietatea și a ajutat la menținerea structurilor sinaptice care se degradează odată cu vârsta. Aceste rezultate oferă dovezi că administrarea intranazală de Hsp70 ar putea avea un potențial terapeutic semnificativ în conservarea țesutului cerebral și a memoriei pentru persoanele de vârstă mijlocie și vârstnice și ar putea fi aplicate fie ca tratament unic autonom, fie în combinație cu alte terapii farmacologice.

Abstract

Din câte știm, efectul HSP-urilor exogene asupra longevității nu a fost încă investigat. Am arătat anterior că Hsp70 injectat intranazal a intrat rapid în creierul șoarecilor de tip sălbatic și a fost transportat în neuroni (23, 24). Mai mult, tratamentul cronic cu Hsp70 a ameliorat tulburări multiple de comportament și moleculare în două modele de neurodegenerare de tip boala Alzheimer (AD) (23). În acest studiu, am explorat potențialul de geroprotecție al Hsp70 exogen recombinant (eHsp70) la șoareci sănătoși. Pentru toate experimentele descrise, am folosit eHsp70 uman (25) extrem de pur fără LPS, care exclude posibilitatea confuziei răspunsurilor inflamatorii asociate cu Hsp70 contaminat. Rezultatele noastre demonstrează că administrarea intranazală pe termen lung de eHsp70 uman îmbunătățește longevitatea și ameliorează deficite comportamentale legate de îmbătrânire și modificări moleculare ale structurii sinaptice din creierul șoarecilor în vârstă.

Rezultate

Durată de viață prelungită a tratamentului eHsp70.

Tratamentul cronic cu eHsp70 a prelungit în mod semnificativ durata de viață a animalelor în vârstă atunci când administrarea eHsp70 a început la vârsta de 17 luni (Fig. 1A, Tabelul 1 și Tabelul S1). În mod similar, s-a observat un efect pronunțat în supraviețuire atunci când administrarea a început la vârsta de 12 luni, indicând că au răspuns și animalele de vârstă mijlocie (Fig. 1, Tabelul 1 și Tabelul S1). Este de remarcat faptul că, deși tratamentul cu eHsp70 a crescut doar moderat durata maximă de viață (Tabelul 1), rata generală a mortalității la animalele tratate cu eHsp70 a fost mult mai mică comparativ cu grupurile de control (Tabelul 1). După 22 de luni, în grupul de vârstă mijlocie netratat, supraviețuirea a fost puțin peste 22%, în timp ce în grupul experimental aproape 55,5% erau încă în viață. După 22 de luni, în grupul de bătrâneți netratat, supraviețuirea a fost puțin peste 35,2%, în timp ce în grupul experimental aproape 54,5% erau încă în viață (Fig. 1B și Tabelul 1).

Parametrii duratei de viață a șoarecilor RMN tratați și netratați cu Hsp70

Efectul eHsp70 asupra distribuției supraviețuirii în grupuri de șoareci masculi de vârstă mijlocie și vârstnici RMN

eHsp70 Îmbunătățirea învățării și ameliorarea deficienței de memorie observate la animalele vechi.

Efectul administrării eHsp70 asupra densității neuronilor. Am evaluat densitatea neuronală în cortexul temporal (A) și zona hipocampică CA1 - CA2 (B) la șoareci tineri și bătrâni. Axa x reprezintă grupurile experimentale: șoareci de 2,5 luni (n = 6); șoareci bătrâni netratați (n = 5; vârsta 26,2 ± 2,61 luni); și șoareci bătrâni tratați cu eHsp70 timp de 9 luni (n = 5; vârstă 28,2 ± 3,12). Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM. * Glicoproteina care leagă P 2+ se găsește pe scară largă în membranele presinaptice și veziculele neurotransmițătoare. Este o componentă majoră a veziculelor sinaptice și joacă un rol important în traficul de vezicule (30 ⇓ –32). Nivelul de sinaptofizină reflectă în mod direct sănătatea sinapselor și este redus la primatele în vârstă (33). Prin urmare, a fost de mare interes să se determine dacă tratamentul cu eHsp70 a modificat concentrația de sinaptofizină. Au fost măsurate zonele de imunocolorare a sinaptofizinei în felii de cortex temporal, zone hipocampice CA1 și CA3. La șoareci vechi tratați cu eHsp70, zonele imunopozitive cu sinaptofizină au fost semnificativ mai mari în toate regiunile creierului studiate decât la animalele martor de aceeași vârstă și au fost similare cu cele observate la animalele de vârstă mijlocie (Fig. 5A).

Efectul protector al tratamentului cu eHsp70 asupra nivelurilor de imunocolorare a lipofuscinei în hipocamp și cortex este evident. Fotomicrografie reprezentativă a lipofuscinei în hipocampus (A) și în cortexul temporal (B) la șoareci vechi tratați cu eHsp70 și de control. (A, i) Vedere generală a hipocampului la animalul tratat cu HSP70. (A, ii) La fel ca A, i la mărire mai mare. (A, iii) Vedere generală a hipocampului la animalul de control. (A, iv) La fel ca A, iii la mărire mai mare. (B, i) Vedere generală a cortexului temporal la animalul martor. (B, ii) La fel ca B, ii la mărire mai mare. (B, iii) Vedere generală a cortexului temporal la animalul martor. (B, iv) La fel ca B, iiii, la o mărire mai mare. [Barele la scară: 20 μm (vederi generale ale cortexului și hipocampului); 5 μm (fotografii cu mărire mai mare).]

eHsp70 a promovat activitatea proteazomului în cortexul șoarecilor bătrâni.

Am emis ipoteza că eHsp70 își exercită efectele de protecție asupra comportamentului prin scăderea producției și/sau acumulării de proteine ​​deteriorate în creier. Scăderea observată a reactivității lipofuscinei neuronale (Fig. 5B) ca răspuns la eHsp70 susține această noțiune. Majoritatea proteinelor intracelulare sunt degradate de proteazomi; astfel, activitatea catalitică a proteazomilor este critică pentru procesul homeostatic. Deoarece activitatea proteazomului scade odată cu vârsta în creier (38), am investigat dacă tratamentul cu eHsp70 a modificat activitatea proteazomului în creierul șoarecilor tratați.

Omogenatele de țesut cerebral au fost obținute de la opt animale tratate cu eHsp70 și cinci șoareci de control RMN (șoareci de 2 ani au fost utilizați în toate experimentele). Pentru a caracteriza funcția proteazomului în aceste țesuturi, s-au determinat activitățile asemănătoare caspazei și chimotripsinei și expresia subunităților proteazomale. Activitatea asemănătoare caspazei la corticile animalelor de control a fost comparabilă cu cea detectată în creierul șoarecilor tratați cu eHsp70. În schimb, activitatea asemănătoare chimotripsinei la șoareci din grupul eHsp70 a fost semnificativ crescută (17%; Fig. 5C). Am analizat compoziția subunității proteazomilor din lizat prin Western blot (Fig. S4). La omogenatele de la animale tratate cu eHsp70, a existat o creștere semnificativă a expresiei subunității Rpt6 (20%). Exprimarea subunității β6 a fost crescută cu 66%, iar subunitatea β5i a fost crescută cu 139% (Fig. 5D). Aceste descoperiri sugerează că activitatea crescută asemănătoare chimotripsinei în lizatele de la animalele tratate cu eHsp70 se datorează probabil cantității crescute de proteazomi care conțin subunitatea β5i.

Acumularea de subunități proteazomale în lizatele cortexului cerebral ale șoarecilor martor și experimentali. Proteinele au fost detectate prin Western blot cu anticorpi specifici la 20S proteazom α1,2,3,5,6,7 subunități; 19S subunitatea regulatorului Rpt6; PA28 subunitate alfa; subunitățile beta β6, β5, β1i, β5i și la IFN-γ. După dezvoltare, membranele au fost decupate și colorate cu anticorpi anti - β-actină pentru normalizarea semnalului. Western blot au fost repetate de trei ori.

Discuţie

Procesele inflamatorii și oxidative cumulative contribuie la îmbătrânire și reducerea la minimum a acestor procese poate contribui la prelungirea duratei de viață activă a unei persoane. HSP-urile, în special Hsp70, oferă rezistență la stres, iar inducția lor poate crește toleranța la stres și prelungi longevitatea (9, 13). În studiile anterioare, am explorat două modele de șoarece de neurodegenerare asemănătoare AD și am constatat că administrarea intranazală a eHsp70 a normalizat densitatea neuronilor în zonele neocorticale și hipocampice. Această constatare s-a corelat cu acumularea diminuată de β-amiloid. Tratamentul eHsp70 a protejat, de asemenea, memoria spațială în ambele modele (23).

Pe baza acestor rezultate, am investigat efectele administrării cronice de eHsp70 asupra parametrilor comportamentali și moleculari ai îmbătrânirii. Am constatat că tratamentul cu eHsp70 a crescut în mod substanțial durata mediană de viață la ambele grupe de vârstă examinate (Tabelul 1 și Fig. 1). În plus, tratamentul a îmbunătățit mulți parametri comportamentali la șoareci vechi, inclusiv comportamentul explorator și memoria spațială. Important, perioada mai lungă de tratament a dus la o mai mare protecție în aproape toți parametrii studiați.

Potențialul tratamentului cu eHsp70 pentru a proteja mașinile sinaptice la animalele vechi este de o mare relevanță pentru bolile neurodegenerative, cum ar fi AD și boala Parkinson. Un mecanism care stă la baza rezultatelor noastre poate fi efectul neuroprotector al Hsp70 asupra mașinilor sinaptice. O investigație a localizării recombinante a Hsp70 după injecția intracerebroventriculară a găsit proteina în neuroni și s-a colocalizat cu sinaptofizină (39). În studiul prezent, densitatea totală a neuronilor a fost semnificativ mai mare în cortex și în zonele CA1 - CA2 ale hipocampului în creierul șoarecelui tratat cu eHsp70. Această constatare confirmă datele noastre anterioare care demonstrează o densitate neuronală semnificativ mai mare în regiunile creierului șoarecilor 5XFAD tratați cu eHsp70 comparativ cu șoarecii martor (23).

Căile specifice de semnalizare activate prin administrarea intranazală de eHsp70 sunt necunoscute. Menținerea sintezei, plierii și degradării normale a proteinelor, care poate fi perturbată în timpul îmbătrânirii, depinde de sute de gene (1, 3, 40). Este posibil ca administrarea intranasală prelungită a eHsp70 să amelioreze inflamația cronică observată caracteristic în țesuturile neuronale îmbătrânite, potențial prin scăderea producției reactive de oxigen și a citokinelor proinflamatorii; a fost demonstrat un efect antiinflamator al eHsp70 (22, 23, 40 ⇓ ⇓ –43).

Dovezile de la C. elegans și Drosophila indică o legătură între proteostaza neuronală și îmbătrânirea somatică (44, 53 ⇓ –55). Răspunsul la stres și menținerea homeostaziei proteinelor în aceste organisme sunt orchestrate cel puțin parțial prin intermediul controlului neuronal nonauton celular. Prezentul studiu sugerează că controlul neautonom al celulelor neuronale al îmbătrânirii funcționează și la mamifere. Această constatare ridică întrebări interesante cu privire la homeostazia proteinelor neuronale și rolul său în îmbunătățirea duratei de viață și diminuarea patologiei asociate îmbătrânirii în țesuturile periferice. Datele noastre sugerează că eHsp70 poate fi utilizat ca un instrument molecular puternic în dezvăluirea căilor de semnal candidate și identificarea țintelor terapeutice pentru îmbătrânirea și bolile neurodegenerative.

Materiale și metode

eHsp70.

Hsp70 recombinant uman exprimat în celule de vierme de armată (Spodoptera frugiperda) a fost purificat așa cum s-a descris (42, 56). Rezultatul eHsp70 a fost lipsit de LPS, după cum a confirmat testul Limulus Amebocyte Lysate (25), care neagă posibilitatea confuziei răspunsurilor inflamatorii asociate cu contaminarea cu Hsp70 de către LPS. FIG. S5 ilustrează puritatea ridicată a eHSP70 utilizat în studiu.