David G. Cotter, 1,2 Baris Ercal, 1 Xiaojing Huang, 1,3 Jamison M. Leid, 1 D. André d'Avignon, 3 Mark J. Graham, 4 Dennis J. Dietzen, 2 Elizabeth M. Brunt, 5 Gary J. Patti, 3,6 și Peter A. Crawford 1,6,7

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

ketogeneza

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

Găsiți articole d’Avignon, D. în: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

Găsiți articole de Dietzen, D. în: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

1 Departamentul de Medicină, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare, 2 Departamentul de Pediatrie și 3 Departamentul de Chimie, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, California, SUA. 5 Departamentul de Patologie și Imunologie și 6 Departamentul de Genetică, Universitatea Washington, St. Louis, Missouri, SUA. 7 Sanford-Burnham Medical Research Institute, Orlando, Florida, SUA.

Adresă corespondență către: Peter A. Crawford, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6400 Sanger Rd., Orlando, Florida 32827, SUA. Telefon: 407.745.2135; E-mail: [email protected].

Notă de autor: David G. Cotter și Baris Ercal au contribuit în mod egal la această lucrare.

Găsiți articole de Crawford, P. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Publicat pe 27 octombrie 2014 - Mai multe informații

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) și steatohepatita nealcoolică (NASH) sunt acum cele mai frecvente cauze ale bolilor hepatice în țările occidentale (1). Insuficiența hepatică indusă de NAFLD este unul dintre cele mai frecvente motive pentru transplantul de ficat. NAFLD crește riscul de a dezvolta diabet de tip 2, înrăutățește controlul glicemic și contribuie la patogeneza bolilor cardiovasculare și a bolilor renale cronice (2 - 4). Mecanismele patogene ale NAFLD și NASH sunt incomplet înțelese, dar se crede că implică anomalii ale metabolismului hepatocitelor, autofagiei hepatocitelor și stresului reticulului endoplasmatic, funcției celulelor imune hepatice, inflamației țesutului adipos și mediatorilor inflamatori sistemici (2, 4 - 6). Perturbările metabolismului carbohidraților, lipidelor și aminoacizilor apar și contribuie la obezitate, diabet și NAFLD la om și la organismele model (revizuite în referințele 7-11). În timp ce anomaliile hepatocitelor în metabolismul lipidic citoplasmatic sunt frecvent observate în NAFLD (12), rolul metabolismului mitocondrial, care guvernează „eliminarea” oxidativă și terminală a grăsimilor, în patogeneza NAFLD este mai puțin clar. Cu toate acestea, majoritatea anchetatorilor sunt de acord că anomaliile metabolismului mitocondrial apar și contribuie la NAFLD (revizuite în referințele 13-15).

Prin mecanisme incomplet definite, hiperinsulinemia asociată cu obezitatea suprimă ketogeneza, creând o stare de insuficiență cetogenă relativă și ducând la hipoketonemie la modelele animale obeze și la oameni în comparație cu controalele slabe (24 - 29). Pentru a testa ipoteza că ketogeneza afectată, chiar și în stări pline de carbohidrați și, prin urmare, „necetogenă”, contribuie la metabolismul anormal al glucozei și provoacă steatohepatită, am generat un model de șoarece cu insuficiență ketogenică marcată și am folosit sisteme complementare abordări fiziologice și 13 C-etichetare - bazate pe măsuri de înaltă rezoluție a dinamicii metabolice pentru a caracteriza efectele pe scară largă ale afectării ketogenice.

Insuficiența ketogenică determină metabolizarea hepatică anormală a glucozei și a lipidelor. Capacitatea ketogenezei de a influența glucoza hepatică și homeostazia lipidică a fost caracterizată doar preliminar. Pentru a determina consecințele alterării cetogenezei în timpul perioadei neonatale puternic ketogenice, șoarecii care alăptează au fost injectați s.c. (25 mg/kg) cu un Hmgcs2-oligonucleotidă antisens vizată (ASO) zilnic, începând cu a doua zi a vieții extrauterine. În comparație cu colegii de gunoi injectați cu ASO de control al secvenței amestecate, am constatat că tratamentul cu HMGCS2 ASO a scăzut abundența de proteine ​​HMGCS2 hepatice cu 70% până la ziua 12 postnatală (P12) (Figura 1A). Acești șoareci au prezentat greutăți corporale normale și concentrații de glucoză în sânge și au prezentat concentrații corporale de cetonă plasmatică ușor scăzute (0,9 ± 0,05 mM față de 1,3 ± 0,17 mM la controale, n = 4-6/grup, P 30 și Figura suplimentară 1, C și D). HMGCS2 imunoreactiv a fost eliminat din ficat la șoareci tratați cu HMGCS2 ASO (Figura 1D). Tratamentul ASO nu a diminuat abundența de proteine ​​a 3-hidroximetilglutaril-CoA sintazei citoplasmatice (HMGCS1), care catalizează penultima reacție în sinteza mevalonatului (Figura suplimentară 1E).

Convergența insuficienței ketogenice, fie cu eliberarea acută de acizi grași, fie cu expunerea cronică la un HFD „necetogen (fără restricție de carbohidrați) are ca rezultat sechele metabolice suplimentare (Figura 8, dreapta) care separă disponibilitatea crescută a grăsimilor de la gluconeogeneza crescută prin mecanisme care pot fi legat de sechestrarea CoASH liber, un produs secundar critic al cetogenezei. Prin urmare, în ciuda activării alosterice probabil crescute a carboxilării piruvatului, gluconeogeneza devine afectată prin mecanisme care pot fi legate de o disponibilitate redusă a CoASH. CoASH eliberat de ketogeneză este esențial în stările de livrare cu conținut ridicat de grăsimi, în parte servind ca substrat pentru reacția α-KG dehidrogenază, pentru a susține funcția ciclului TCA homeostatic, care în hepatocite este un regulator cheie al gluconeogenezei. În mod ciudat, cantitatea totală de triacilglicerol hepatic nu s-a extins în ficatul animalelor insuficiente de cetogeneză alimentate cu HFD în comparație cu cea observată la controale, sugerând fie limitarea relativă a substratului (de exemplu, glicerol), afectarea acilglicerol transferazei citoplasmatice, fie fosfatidatul fosfatazei, sau intrarea lanțurilor acil în alte căi sintetice.

Studiile de asociere la nivel de genom și secvențierea exomei au relevat relații între numeroase gene care codifică mediatori ai metabolismului lipidelor și NAFLD/NASH (64, 65). Variațiile genelor care codifică mediatori ketogeni, inclusiv HMGCS2, HMG-CoA lyase și βOHB dehidrogenază, nu au apărut încă ca predictori independenți ai patologiei hepatice sau diabetului. În timp ce deficitul de HMGCS2 este foarte rar la om, deficitul enzimatic total de HMGCS2 este asociat cu hipoglicemie hipoketonemică pediatrică și steatoză hepatică (66 - 71). Foarte important, studiile noastre la șoareci neonatali au arătat că pierderea parțială a activității HMGCS2 a cauzat steatoză hepatică marcată disproporționat de diminuarea cetozei neonatale, dar nu a dus la hipoglicemie neonatală sau la eșecul prosperării. Aceste descoperiri ridică posibilitatea ca polimorfismele genetice care produc defecte cetogene insidioase și subtile să predispună latent la boli hepatice grase și să ateste rolul critic de reglare fină pe care ketogeneza hepatică îl joacă în reglarea glucozei hepatice și a metabolismului lipidelor.

Informații suplimentare pot fi găsite în Metodele suplimentare.

Măsurători ale consumului de alimente, greutatea corporală și compoziția corporală. Aportul alimentar a fost monitorizat începând cu ziua 1 a tratamentului cu ASO pentru fiecare cușcă de șoareci. Aportul de alimente a fost măsurat bisăptămânal pe durata fiecărui experiment și normalizat la numărul de șoareci pe cușcă și numărul de zile dintre măsurători, care a fost întotdeauna de 3 sau 4 zile. Șoarecii au fost, de asemenea, cântăriți săptămânal la debutul tuturor experimentelor. Greutatea corporală și compoziția corporală au fost înregistrate în urma unui post de 4 ore (1000-1400), după care alimentele au fost returnate imediat. Procentul de grăsime corporală și masa corporală slabă a fost cuantificat la animalele adulte trezite folosind un instrument EchoMRI (Echo Medical Systems).

Cuantificarea metabolitului plasmatic. Parametrii metabolici ai serului și sângelui au fost măsurați în probe recoltate după un post de 4 ore, așa cum s-a descris anterior (31).

Cuantificarea metabolitului țesutului. Concentrațiile hepatice TAG au fost cuantificate biochimic folosind un extract de ficat Folch, așa cum s-a descris anterior (79). Concentrațiile țesutului CoASH, NAD + și NADH au fost măsurate în țesutul hepatic congelat și biopulverizat. Pentru CoASH, aproximativ 75 mg de țesut au fost omogenizați folosind un strat de sticlă pe sticlă în volum de 10 × apă deionizată rece cu gheață. Omogenatele au fost filate la 15.000 g timp de 20 de minute la 4 ° C. Supernatantele au fost transferate în tuburi curate pe gheață și apoi au fost deshidratate folosind un vid de viteză rotativă. Peletele de țesut au fost resuspendate la 2 mg/μl și 20 mg de țesut (10 μl) au fost încărcate într-o placă cu 96 de godeuri pentru concentrații de CoASH și acil-CoA cu lanț lung folosind un test colorimetric legat de enzime (BioVision). Concentrațiile de NAD + (H) au fost măsurate utilizând o analiză colorimetrică cu ciclu enzimatic (BioVision).

Histologie. Imediat după sacrificiu, specimenele de ficat au fost colectate și fixate în 10% formalină tamponată neutră (Fisher Scientific) sau crioconservate într-un compus de temperatură optimă de tăiere (O.C.T.; Tissue-Tek).

Analiza expresiei genelor. Cuantificarea expresiei genelor a fost efectuată prin PCR cantitativă în timp real cu transcriptază inversă utilizând abordarea ΔΔCt, așa cum s-a descris anterior (31), normalizându-se Rpl32, folosind secvențele de exemplu enumerate în Tabelul suplimentar 6.

Imunoblotarea. Imunoblotii pentru detectarea HMGCS2 (iepure anti-mHMGCS; Santa Cruz Biotechnology Inc.), HMGCS1 (iepure anti-HMGCS1; Thermo Fisher Scientific) și actină (iepure anti-actină; Sigma-Aldrich) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (32).

Cartografierea destinului substratului cantitativ bazat pe RMN. Extractele de țesut neutralizat ale acidului percloric au fost preparate și profilate folosind RMN de proton editat la 13 C, așa cum s-a descris anterior (32, 33).

Analiza în tandem a acilcarnitinelor din sânge. Esterii carnitinei au fost măsurați prin scanarea precursorilor comunului m/z Fragment de carnitină 85 într-un protocol LC cu fază inversă cuplat la SM tandem (MS/MS), așa cum a fost descris anterior (80).

Tabelul cu caracteristici a fost apoi procesat în R pentru a căuta caracteristici ale căror m/z potrivite cu speciile din calea de alungire a acizilor grași așa cum este detaliat în KEGG (38, 39). S-a luat în considerare îmbogățirea etichetelor de 13 C în fiecare specie prin gruparea caracteristicilor cu timpi de retenție similari (12 C și 13 C (1.00335 amu). În cazul în care mai multe grupuri de astfel de caracteristici, cunoscute sub numele de izotopologi, se potrivesc cu o singură specie de acil-CoA, o selecție a grupului unic căruia i-a fost atribuită specia a fost făcută pe baza următoarelor criterii: (a) minimum 3 izotopologi reprezentați în grup; (b) diferență semnificativă statistic (P Marcaje de 13 C care ar fi încorporate în acea moleculă. Identitatea acetil-CoA a fost verificată utilizând un standard de acetil-CoA (Sigma-Aldrich) dizolvat în 1: 1 ACN/apă, cu observarea 808.1140 și 808.1127 m/z vârfuri unice la timpi de retenție de 37,9 și respectiv 40,0 minute. Intensitățile însumate ale acestor vârfuri și grupurile lor izotopologe asociate au fost apoi determinate în extracte hepatice de control și animale tratate cu HMGCS2 ASO.

Pentru a cuantifica etichetarea diferențială a 13 C a caracteristicilor identificate, fișierele mzXML descrise mai sus au fost procesate în R utilizând XCMS (84) și X 13 CMS (40), acestea din urmă fiind modificate pentru a detecta diferențele în modelele de îmbogățire a 13 C ale metaboliților extrasați din [3-13 C] martor marcat cu piruvat/lactat versus ficat cu deficit de HMGCS2 (spre deosebire de utilizarea obișnuită, în care sunt detectate diferențe între probele nemarcate și marcate de același tip biologic). Modelele de îmbogățire sunt definite ca distribuția abundenței de metaboliți între diferitele forme izotopologice ale unui anumit metabolit. Diferențele de tipare au fost definite ca modificări ale formei acestei distribuții între tipurile de probe biologice, de exemplu, controlul față de cetogeneză insuficient.

Izolarea și respirația mitocondrială. Studiile de izolare și respirație mitocondrială au fost efectuate și evaluate așa cum s-a descris anterior (79, 85).

Statistici. Analizele au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Student cu două cozi fără pereche t testele și ANOVA bidirecțională, cu corecția lui Bonferroni pentru a corecta comparații multiple, au fost utilizate după caz, după cum se indică în legendele textului și figurii. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM, cu excepția cazului în care se indică altfel. A P valoarea mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă, cu excepția studiilor LC/MS, în care a P valoarea mai mică de 0,01 a fost considerată semnificativă.

Aprobarea studiului. Toate experimentele au fost efectuate folosind protocoale aprobate de Comitetul pentru Studii pe Animale de la Universitatea Washington.