Subiecte

Abstract

Introducere

Se crede că probioticele exercită diferite efecte benefice asupra sănătății umane 8. Noi și alte grupuri am arătat recent că administrarea bacteriilor probiotice la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) promovează oxidarea acizilor grași în țesuturile metabolice, reducând adipozitatea și protejând astfel împotriva obezității induse de dietă și a tulburărilor metabolice asociate acesteia 9,10, 11.12. Acest lucru sugerează că acest efect benefic al bacteriilor probiotice poate fi asociat cu conversia bej a WAT; în consecință, am emis ipoteza că unele probiotice pot promova sau induce rumenirea adipocitelor albe, care, la rândul lor, pot facilita consumul de energie și proteja împotriva obezității induse de dietă. Aici, demonstrăm că administrarea de Lactobacillus amylovorus KU4 (LKU4), o bacterie probiotică, la șoareci hrăniți cu HFD a crescut nivelurile mitocondriale și exprimarea genelor selective BAT în iWAT, cu o creștere concomitentă a temperaturii corpului; în plus, arătăm, de asemenea, că lactatul mediază aceste efecte ale LKU4 asupra rumenirii adipocitelor albe prin remodelarea complexului de transcripție PPARγ prin trecerea RIP140 la PGC-1α, ducând în consecință la protecția împotriva obezității induse de HFD.

Rezultate

Administrarea LKU4 a îmbunătățit obezitatea indusă de HFD

indusă

Administrarea LKU4 a promovat un fenotip de tip BAT în iWAT subcutanat la șoareci HFD

LKU4-CM a facilitat rumenirea adipocitelor 3T3-L1

LKU4 a îmbunătățit activitatea PPARγ prin schimbarea raportului PGC-1α la RIP140 asociat cu PPARγ

Lactatul este un metabolit cheie LKU4 care crește expresia genelor importante pentru rumenirea adipocitelor

Pentru a testa în continuare dacă lactatul ar putea media bruna iWAT indusă de LKU4, am comparat mai întâi efectul tratamentelor cu LKU4-CM și lactat asupra expresiei genelor implicate în rumenirea adipocitelor. În concordanță cu rezultatele tratamentului cu LKU4-CM, nivelurile de ARNm de Ucp1, PPARγ, și PGC-1α au fost crescute în adipocite 3T3-L1 după 5 mM tratament cu lactat (Fig. 5C). În schimb, tratamentul cu lactat a scăzut nivelurile de mARN ale RIP140 genă. Așa cum era de așteptat, tratamentul cu lactat a crescut, de asemenea, nivelurile de proteine ​​UCP1, PPARγ și PGC-1α în adipocite 3T3-L1 cu 1,7-, 2,2 și respectiv de 2 ori, comparativ cu adipocitele martor, în timp ce nivelurile de proteine ​​RIP140 au fost reduse cu 60% (Fig. 5D). În plus, eliminarea MCT1 de către ARNsi specifice MCT1 a redus expresia Ucp1 genă de 47

51% dintre cei din adipocite tratate cu LKU4-CM, sugerând că lactatul este esențial pentru rumenirea adipocitelor indusă de LKU4-CM (Informații suplimentare Fig. 3).

Lactatul a facilitat rumenirea adipocitelor 3T3-L1 prin modularea interacțiunii PGC-1α și RIP140 cu PPARγ

Discuţie

Dezechilibrul metabolic datorat aportului ridicat de energie și consumului redus de energie determină obezitate și complicațiile metabolice asociate acestuia 18. Recent, inducerea unui fenotip asemănător adipocitelor maronii în iWAT a fost considerată o abordare terapeutică potențială pentru tratamentul obezității induse de dietă prin promovarea cheltuielilor de energie 5. Aici, am demonstrat că administrarea de LKU4, o bacterie probiotică, la șoareci HFD a dus la creșterea nivelului și activității mitocondriale și a îmbunătățit expresia genelor specifice BAT, cum ar fi Ucp1 și Cidea în iWAT; la rândul său, aceasta a activat rumenirea adipocitelor și a îmbunătățit temperatura corpului, rezultând în protecția împotriva obezității induse de dietă. Conform cu in vivo rezultate, in vitro Tratamentul cu LKU4-CM a provocat același efect asupra biogenezei mitocondriale și asupra expresiei genei BAT, ducând la creșterea OCR-urilor în adipocitele 3T3-L1.

Materiale și metode

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante.

Experimentarea pe animale

Toate studiile pe animale au fost efectuate conform procedurilor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Națională Chonnam. C57BL/6 șoareci masculi (în vârstă de 7 săptămâni; greutate, 19 ± 2 g; Damul Science, Daejeon, Coreea) au fost hrăniți fie cu o dietă normală (ND; 16% din totalul caloriilor obținute din grăsimi, Damul Science), fie cu HFD 45 % din totalul caloriilor obținute din grăsimi, Research Diets Inc., New Brunswick, SUA) în cadrul unui ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Celulele LKU4 au fost cultivate în bulion MRS și resuspendate în PBS la

1,0 × 108 cfu/ml și 200 μL din această resuspendare LKU4, sau PBS, au fost administrate pe cale orală zilnic la șoareci timp de 14 săptămâni.

Cultura celulară, transfecția și prepararea LKU4-CM

Imunohistochimie

Pentru analiza histologică, țesuturile au fost fixate cu o soluție de formalină 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, SUA) în PBS (pH 7,4) și apoi încorporate în parafină. După deshidratare în serie, țesuturile secționate au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Pentru a evalua dimensiunea adipocitelor, axele lungi și scurte au fost măsurate și mediate. Datele numerice obținute folosind ImageJ sunt prezentate ca mijloace ± S.E.M. Pentru imunohistochimie pe probe de țesut, țesuturile fixate în formalină au fost secționate congelate. Anticorpii anti-UCP1 (SH2436525, 1: 500, Invitrogen, Carlsbad, SUA) și anti-VDAC2 (ab37985, 1: 200, AbCam, Cambridge, Marea Britanie) au fost folosiți ca anticorpi primari. Ca anticorpi secundari s-au folosit anticorpi anti-iepure de capră conjugată Alexa 488 (1: 500) și, respectiv, anticorpi anti-capră de măgar conjugată Alexa 568 (1: 1000). Nucleii au fost contracolorați cu DAPI.

Testele RT-qPCR, ChIP, imunoblot și imunoprecipitare

ARN-ul total extras din celule sau țesuturi cultivate a fost transcris invers în ADNc folosind M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, SUA). Analiza RT-qPCR a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 9 și nivelurile de ARN 36B4 au fost utilizate ca control pentru cuantificarea fiecărei gene. Testele ChIP au fost efectuate folosind IgG și anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α și anti-RIP140 normali în adipocite 3T3-L1. Secvențele primare pentru PCR sunt enumerate în Tabelul de informații suplimentare 1. Imunoblotarea a fost efectuată folosind anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α, anti-RIP140, anti-UCP1 și anti-β-actină, așa cum s-a descris anterior 9. Pentru testele IP, țesuturile și adipocitele 3T3-L1 au fost lizate în tampon RIPA prin rotirea incubării la 4 ° C timp de 20 min. După o scurtă sonicare, lizatele au fost imunoprecipitate folosind anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α și anti-RIP140. Imunoprecipitatele au fost ulterior analizate prin imunoblotare.

Analize plasmatice și tisulare

Nivelurile plasmatice de glucoză, insulină și lactat au fost măsurate folosind un glucometru (OneTouch, LifeScan, Milpitas, SUA), un kit ELISA pentru insulină (ALPCO, Salem, NH, SUA) și un kit de testare a lactatului (Biovision, Milpitas, SUA), respectiv, conform protocoalelor recomandate de producători. Nivelurile de trigliceride ale țesutului (ficat, iWAT și eWAT) au fost măsurate folosind un kit de testare a trigliceridelor (Biovision, Milpitas, SUA) conform protocolului recomandat de producător. După 16 ore de post, un test de toleranță la glucoză (GTT) a fost efectuat la șoareci prin injecție intraperitoneală de glucoză (1 g/kg greutate corporală). Pentru testul de toleranță la insulină (ITT), insulina a fost injectată intraperitoneal la 0,75 U/kg greutate corporală. Nivelul glicemiei a fost măsurat la 0, 15, 30, 60 și 90 min după administrarea de glucoză sau insulină.

Analize ale ADN-ului mitocondrial, ale activității citrate sintazei și ale consumului de oxigen

ADN-ul mitocondrial (ADNmt) a fost izolat din adipocite iWAT și 3T3-L1 folosind un kit de izolare mitocondrială (Biovision, Milpitas, SUA) și s-a efectuat qPCR pentru a determina numărul de copii ale ADNmt folosind primerii mtDNA (Tabelul 1 cu informații suplimentare). Activitatea citratului sintază a fost măsurată în adipocite iWAT și 3T3-L1 utilizând un kit de testare a activității citratului sintazat (Biovision, Milpitas, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru măsurarea OCR, adipocitele diferențiate 3T3-L1 au fost însămânțate pe microplăci de cultură celulară XFp (Seahorse Bioscience, North Billerica, SUA) conținând 80 μL de mediu de creștere (Seahorse Bioscience, North Billerica, SUA) și incubate într-un incubator de CO2 la 37 ° C timp de 24 de ore. Un analizor Seahorse Bioscience XFp a fost folosit pentru a evalua modificările nivelurilor de oxigen dizolvat în mass-media. Toate procedurile au urmat protocoalele recomandate de producători.

analize statistice

Studentii t-testul a fost utilizat pentru analize statistice ale datelor. Datele au fost exprimate ca mijloace ± S.D. sau S.E. Toate experimentele au fost efectuate cel puțin în trei exemplare. Testul ANOVA a fost utilizat pentru a distinge nivelul de semnificație.

Disponibilitatea datelor

Seturile de date generate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Referințe

Arner, P. și colab. Dinamica fluctuației lipidelor adipoase umane în sănătate și boli metabolice. Natură 478, 110-3 (2011).

Ussar, S. și colab. Interacțiunile dintre Microbiota intestinală, Genetica gazdei și Dieta Modulează predispoziția la obezitate și sindrom metabolic (vol 22, pg 516, 2015). Metabolismul celular 23, 564–566 (2016).

Jankovic, A. și colab. Reglarea fiziologică și rolul metabolic al rumenirii în țesutul adipos alb. Horm Mol Biol Clin Investig 31 (2017).

Bartelt, A. & Heeren, J. Rumenirea țesutului adipos și sănătatea metabolică. Nat Rev Endocrinol 10, 24–36 (2014).

Cui, X. B. și Chen, S. Y. Rumenirea țesutului adipos alb și obezitatea. J Biomed Res 31, 1-2 (2016).

Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M. și Kajimura, S. Agoniștii gamma PPAR induc o conversie a grăsimii alb-maro prin stabilizarea proteinei PRDM16. Metabolismul celular 15, 395–404 (2012).

Kiskinis, E. și colab. RIP140 reprimă programul adipocitar „maro-în-alb”, incluzând un ciclu inutil de descompunere și sinteză a triacilglicerolului. Mol Endocrinol 28, 344–56 (2014).

Kechagia, M. și colab. Beneficiile probiotice asupra sănătății: o revizuire. ISRN Nutr 2013, 481651 (2013).

Park, S. S. și colab. Lactobacillus acidophilus NS1 atenuează obezitatea indusă de dietă și ficatul gras. J endocrinol 237, 87-100 (2018).

Kim, Y. A., Keogh, J. B. și Clifton, P. M. Probiotice, prebiotice, sinbiotice și sensibilitate la insulină. Rev. Nutr Res 31, 35-51 (2018).

Eslamparast, T., Eghtesad, S., Hekmatdoost, A. & Poustchi, H. Probiotice și boală hepatică grasă nealcoolică. Orientul Mijlociu J Dig Dis 5, 129–36 (2013).

Kobyliak, N. și colab. Probiotice în prevenirea și tratamentul obezității: o viziune critică. Nutr Metab (Londra) 13, 14 (2016).

Sidossis, L. S. și colab. Rumenirea țesutului adipos alb subcutanat la oameni după stresul adrenergic sever. Cell Metab 22, 219-27 (2015).

Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B. & Keating, D. J. Influența microbiomului intestinal asupra metabolismului gazdei prin reglementarea eliberării hormonului intestinal. Fiziol frontal 10, 428 (2019).

Lee, G. și colab. Postul intermitent promovează rumenirea adiposului alb și scade obezitatea prin modelarea microbiotei intestinale. Cell Metab 26, 801 (2017).

Brooks, G. A. The Science and Translation of Lactate Shuttle Theory. Metabolismul celular 27, 757–785 (2018).

Gill, J. A. și La Merrill, M. A. Un rol emergent pentru reglarea epigenetică a expresiei Pgc-1alpha în termogeneza adipoasă maro stimulată de mediu. Environ Epigenet 3, dvx009 (2017).

Turnbaugh, P. J. și Gordon, J. I. Microbiomul intestinal de bază, echilibrul energetic și obezitatea. J Fiziol 587, 4153–8 (2009).

Rosell, M., Jones, M. C. și Parker, M. G. Rolul corepresorului receptorului nuclear RIP140 în sindromul metabolic. Biochim Biophys Acta 1812, 919–28 (2011).

Leonardsson, G. și colab. Corepresorul receptorului nuclear RIP140 reglează acumularea de grăsime. Proc Natl Acad Sci SUA 101, 8437–42 (2004).

Lo, K. A. și Sun, L. Transformarea WAT ​​în BAT: o revizuire a regulatorilor care controlează rumenirea adipocitelor albe. Rapoarte privind biosștiința 33, 711–719 (2013).

Rooks, M. G. și Garrett, W. S. Microbiota intestinală, metaboliții și imunitatea gazdei. Nat Rev Immunol 16, 341–52 (2016).

Louis, P., Hold, G. L. și Flint, H. J. Microbiota intestinală, metaboliții bacterieni și cancerul colorectal. Nat Rev Microbiol 12, 661–72 (2014).

Carriere, A. și colab. Rumenirea celulelor adipoase albe de către metaboliții intermediari: un mecanism adaptativ pentru a atenua presiunea redox. Diabet 63, 3253–65 (2014).

Ganapathy, V. și colab. Transportori de monocarboxilat cuplați cu sodiu în țesuturile normale și în cancer. AAPS J. 10, 193–9 (2008).

Petersen, C. și colab. Expresia MCT1 și MCT4 și activitatea fluxului de lactat cresc în timpul adipogenezei albe și maronii și al metabolizării adipocitelor de impact. Sci Rep 7, 13101 (2017).

Kim, E. și colab. Receptorul nuclear orfan TR4 funcționează ca un modulator al apoptozei prin reglarea expresiei genei Bcl-2. Comunicări de cercetare biochimică și biofizică 361, 323-328 (2007).

Wang, H., Berschneider, H. M., Du, J. & Black, D. D. Secreția de apolipoproteine ​​și sinteza lipidelor: reglarea prin acizi grași în celulele epiteliale intestinale ale porcului nou-născut. Sunt J Physiol 272, G935–42 (1997).

Rim, J. S. și Kozak, L. P. Motive de reglementare pentru proteina care leagă CREB și factorii de transcripție Nfe2l2 în amplificatorul din amonte al genei proteinei 1 de decuplare mitocondrială. J Biol Chem 277, 34589–600 (2002).

Park, S. S., Choi, H., Kim, S. J., Chang, C. și Kim, E. Calea de semnalizare CREB/GSK-3beta reglează expresia genei receptorilor orfani TR4. Endocrinol cu ​​celule Mol 423, 22-9 (2016).

Itoh, K., Maejima, K., Ueda, K. și Fujiwara, K. Efectul florei intestinale asupra megaenteronului șoarecilor. Microbiol Immunol 22, 661–72 (1978).

Mulțumiri

Această cercetare a fost susținută de Programul de cercetare științifică de bază prin Fundația Națională de Cercetare din Coreea (NRF) finanțat de Ministerul Științei, TIC și Planificarea Viitoare (NRF-2015R1A2A2A01007467) și Ministerul Educației (2018R1D1A1B07047076). Îi suntem recunoscători Dr. Robert A. Kozak pentru furnizarea de reactiv pentru acest studiu.

Informatia autorului

Adresa actuală: Divizia de cercetare și dezvoltare, Institutul Mondial al Kimchi, 86 kimchi-ro, Nam-gu, Gwangju, 61755, Republica Coreea

Afilieri

Departamentul de Științe Biologice, Colegiul de Științe ale Naturii, Universitatea Națională Chonnam, 77 Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju, 61186, Republica Coreea

Sung-Soo Park, Yeon-Joo Lee, Garam Yang, Eun Jeong Hong și Eungseok Kim

Divizia de Științe Animale, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chonnam, 77 Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju, 61186, Republica Coreea

Divizia de Științe Analitice, Institutul Coreean de Științe de Bază, 169-148 Gwahak-ro, Yuseong-gu, Daejeon, 34133, Republica Coreea

Hyuno Kang și Jin Yeong Lim

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar