Abstract

fundal

Termogeneza afectată poate favoriza obezitatea. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a investiga dacă expresia genelor legate de termogeneză este modificată în țesuturile adipoase ale indivizilor obezi și dacă metilarea excesivă a promotorilor lor este implicată în acest fenomen.

Metode

Expresia genelor care codifică receptorii β adrenergici (ADRB-uri), receptorii hormonului tiroidian (THR-uri), 5’-iodotironina deiodinaze (DIO) și proteine ​​de decuplare (UCP-uri) a fost măsurată prin PCR în timp real la țesuturile adipose viscerale și subcutanate a 58 de obezi (IMC> 40 kg/m2) și 50 subțiri (IMC 20-24,9 kg/m2). Starea de metilare a acestor gene a fost studiată prin metoda PCR în timp real cu digestie sensibilă la metilare.

Rezultate

Expresia lui ADRB2, ADRB3, THRA, THRB, PARTEA 2, UCP2 a fost semnificativ mai scăzută în țesuturile adipoase ale pacienților obezi decât în ​​țesuturile persoanelor cu greutate normală (P

fundal

Dezechilibrul dintre consumul și consumul de energie este una dintre principalele cauze ale obezității [1]. Deoarece majoritatea tratamentelor obezive non-invazive disponibile în prezent sunt ineficiente pe termen lung, trebuie dezvoltate noi strategii terapeutice pentru a reduce adipozitatea excesivă [2].

Există dovezi crescânde că perturbările căilor legate de termogeneză pot juca un rol în dezvoltarea obezității. Studiile epidemiologice timpurii au arătat că persoanele obeze au cheltuieli energetice mai mici; acest lucru ar putea fi explicat printr-o eficiență mai mică a termogenezei adaptive [13]. Pentru a verifica această ipoteză, au fost create un număr de knock-out-uri animale cu o ablație selectivă a diferitelor gene legate de termogeneză; cu toate acestea, rezultatele acestor studii au fost ambigue și au subliniat complexitatea mecanismelor care controlează termogeneza [14-18]. S-au efectuat, de asemenea, studii privind utilizarea diferiților activatori ai termogenezei în tratamentul obezității și se studiază în prezent o serie de compuși termogeni noi, cum ar fi receptorii sintetici și selectivi ai hormonului tiroidian sau agoniștii receptorilor β-adrenergici [19].

Până în prezent se știe puțin despre modificările fiziologice ale căilor legate de termogeneză în țesutul adipos al oamenilor obezi, iar o astfel de cunoaștere ar constitui o legătură crucială între in vitro experimente și studii farmacologice. În această lucrare arătăm că expresia mai multor gene legate de termogeneză este mai mică în țesuturile adipoase provenite de la indivizi obezi decât în ​​țesuturile participanților la studiu non-obezi și că nivelul de expresie al acestor gene nu este probabil legat de starea de metilare. a promotorilor lor.

Metode

Țesut adipos

S-au obținut o sută șaisprezece probe de țesut adipos visceral (TVA) și subcutanat (SAT) de la 58 de pacienți obezi (indicele de masă corporală (IMC) calculat ca greutate (kg) împărțit la înălțimea pătrată (m 2),> 40 kg/m ) în timpul intervenției chirurgicale bariatrice. Cincizeci de țesuturi martor au fost colectate de la pacienți cu greutate normală (IMC 20-24,9 kg/m2) supuși colecistectomiei elective (TVA, N = 22) sau operați pentru hernie inghinală (SAT N = 28). După colectare, probele au fost imediat congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C. Proiectul a fost aprobat de Comitetul de Bioetică al Universității Medicale din Varșovia (decizia KB/47/2009), iar de la toți participanții a fost obținut un consimțământ informat în scris pentru participarea la acest studiu.

Parametrii biochimici de bază

Parametrii biochimici și hormonali de bază în ser/plasmă la indivizii obezi au fost măsurați în laboratorul de diagnosticare al Spitalului de predare Prunc Iisus al Universității Medicale din Varșovia, conform unei proceduri de rutină.

Izolarea acizilor nucleici, transcrierea inversă și PCR în timp real

Aproximativ 500 mg din fiecare țesut au fost omogenizate în azot lichid și ARN total și ADN au fost extrase cu reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform procedurii producătorului. O sută de nanograme din fiecare ARN au fost folosite pentru transcrierea inversă efectuată cu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilnius, Lituania) conform protocolului producătorului. ADNc rezultat a fost diluat în dH2O fără RNAse (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Apoi, 1 μl de ADNc corespunzător 0,5 ng de ARN total a fost folosit ca șablon în PCR în timp real efectuat în LightCycler 480 Instrument II (Roche, Mannheim, Germania) cu LightCycler 480 Sybr Green I Master Kit (Roche, Mannheim, Germania )) și cu grunduri specifice (Fișa suplimentară 1: Tabelul S1). Condițiile PCR au fost după cum urmează: incubația inițială la 95 ° C timp de 10 min, 40 de cicluri de 95 ° C timp de 12 s, 58-62 ° C timp de 12 s, 72 ° C timp de 12 s și apoi un ciclu de curbă de topire. Toate măsurătorile au fost efectuate în trei exemplare. Rezultatele au fost normalizate în raport cu rezultatele pentru gena β-actină (ACTB) și prezentate în unități arbitrare (AU) ca niveluri medii de ARNm, precum și expresia medie Schimbare ori (FC = 2 -ΔΔCt), considerând că FC este semnificativă dacă 1,50 (reglare în sus).

Analiza metilării

analize statistice

Diferențele în expresia ARNm au fost evaluate cu pachetul software Statistica v.10 (StatSoft, Tulsa, OK) utilizând testul Student's t/Mann-Whitney U sau analiza varianței Kruskal-Wallis. Toate corelațiile dintre valorile cantitative au fost efectuate cu testul de corelație Spearman. Normalitatea distribuției și omogenitatea varianței au fost verificate cu testele Shapiro-Wilk și, respectiv, cu Levene. Pentru a minimiza falsurile pozitive, sa aplicat corecția Bonferroni pentru testarea multiplă, iar nivelul de semnificație a fost stabilit la 0,01.

Rezultate

Grupuri studiate

Grupul de indivizi obezi era format din 49 de femele și 9 bărbați. Caracteristicile lor clinice de bază, parametrii biochimici și starea tiroidei sunt rezumate în Tabelul 1. Sindromul metabolic a fost diagnosticat în 48 (82,7%) pe baza criteriilor Federației Internaționale a Diabetului pentru europeni [www.idf.org]. Toți pacienții care suferă de diabet zaharat de tip 2 și cu o rată de filtrare glomerulară (GFR) ≥60 ml/min au fost tratați cu metformină sau cu o combinație de metformină și sulfoniluree, în timp ce persoanele cu GFR Tabelul 1 Parametri clinici și biochimici selectați ai participanților la studiu

Grupul de control a fost format din 40 de femele și 10 bărbați. În afară de colelitiază sau hernie inghinală, nu au avut antecedente de boli cronice, inclusiv componente ale sindromului metabolic și ale bolilor tiroidiene. Starea lor normală de sănătate a fost confirmată prin examinarea fizică și testele de sânge (Tabelul 1). Deși conținutul lor de țesut adipos nu a fost calculat, pe baza istoricului medical, a valorilor IMC și a parametrilor biochimici, au fost considerați sănătoși din punct de vedere metabolic.

Nu a fost obținut un chestionar dietetic detaliat de la subiecții noștri din studiu; cu toate acestea, calculele bazate pe meniurile tipice au arătat că la persoanele obeze aportul mediu zilnic de calorii a depășit cererea de energie cu cel puțin 1000-1500 kcal la femei și cu 1500-2000 kcal la bărbați. Toți indivizii obezi au condus un stil de viață sedentar.

Exprimarea genelor legate de termogeneză în țesuturile adipoase de la obezi și de la indivizi subțiri

Zece gene au fost incluse în studiu: ADRB1, ADRB2 și ADRB3 codificarea receptorilor adrenergici β1, β2 și β3, PARTEA 1 și PARTEA 2 codificare tip 1 și tip 2 5’-iodotironină deiodinaze, THRA și THRB codificarea receptorilor hormonilor tiroidieni α și β și UCP1, UCP2, UCP3 codificarea decuplării proteinelor 1, 2 și 3. Analiza inițială a arătat că expresiile medii ale acestor gene nu diferă în țesuturile adipoase ale bărbaților și femelelor; prin urmare, toate analizele au fost efectuate pentru ambele sexe împreună.

Analiza expresiei ADRB2 (Figura 1B) și ADRB3 (Figura 1C) a arătat că nivelurile lor medii de ARNm au fost semnificativ mai mici în țesuturile adipoase ale pacienților obezi decât în ​​țesuturile de control al greutății normale (P Figura 1

obezitatea

Comparația expresiei ADRB1 (A), ADRB2 (Grup ADRB3 (C) gene în țesuturile adipose viscerale (TVA) și subcutanate (SAT) ale persoanelor obeze (O) și cu greutate normală (N). Rezultate, normalizate împotriva expresiei ACTB, sunt prezentate ca medie ± deviație standard.

Expresia medie a PARTEA 2 (Figura 2B) a fost semnificativ mai scăzută în țesuturile adipoase ale pacienților obezi decât în ​​grupul de control (P Figura 2

Comparația expresiei PARTEA 1 (A), PARTEA 2 (B), THRA (C) și THRB (D) gene în țesuturile adipose viscerale (TVA) și subcutanate (SAT) ale persoanelor obeze (O) și cu greutate normală (N). Rezultate, normalizate împotriva expresiei ACTB, sunt prezentate ca medie ± deviație standard.

Expresia medie a UCP2 (Figura 3B) a fost semnificativ mai scăzută la țesuturile adipoase ale pacienților obezi decât la persoanele cu greutate normală (P Figura 3

Comparația expresiei UCP1 (A), UCP2 (B) și a UCP3 (C) gene în țesuturile adipose viscerale (TVA) și subcutanate (SAT) ale persoanelor obeze (O) și cu greutate normală (N). Rezultate, normalizate împotriva expresiei ACTB, sunt prezentate ca medie ± deviație standard.

Analiza alternativă utilizând expresia FC (Tabelul 2) a confirmat diferențele descrise mai sus descrise mai sus în ADRB2, ADRB3, PARTEA 2, THRA, THRB și UCP2 nivelurile ARNm.

Experimentele au fost efectuate pe întregul omogenizat al țesutului adipos. Cu toate acestea, constatarea că expresia medie a două gene specifice BAT, UCP1 și PPARG (Figura 3 și fișierul suplimentar 3: Figura S1), a fost similar în toate țesuturile analizate, implică faptul că diferențele în expresia genelor legate de termogeneză nu s-au datorat unui conținut diferit de adipocite bej.

Corelația dintre expresia genelor legate de termogeneză din țesuturile adipoase ale indivizilor obezi și parametrii clinici, biochimici și hormonali

Nivelurile de expresie ale genelor investigate au fost corelate cu elementele clinice de bază (IMC, procentul țesutului adipos, circumferința taliei), biochimice (glucoza serică a jeunului, colesterolul total, lipoproteinele cu densitate scăzută, lipoproteinele cu densitate mare, trigliceridele și concentrațiile de proteine ​​C-reactive), precum și parametrii hormonali (hormon stimulator tiroidian, tiroxină liberă, triiodotironină liberă). Nu s-au găsit corelații semnificative.

Metilarea regiunilor reglatoare ale genelor legate de termogeneză în țesuturile adipoase

Analiza stării metilării genelor de interes a fost precedată de un in Silicon analiza regiunilor lor de reglementare cu CpG Islands Searcher (www.cpgislands.com) și CpG Plot (http://www.ebi.ac.uk). La cinci din șase gene cu niveluri de expresie semnificativ diferite la persoanele obeze și subțiri, și anume la ADRB2, ADRB3, THRA, THRB, și PARTEA 2, analiza a relevat prezența insulelor CpG în promotorii lor. Ulterior, 22 de probe de ADN pentru fiecare genă, 11 reprezentând țesuturi cu un nivel scăzut și 11 reprezentând țesuturi cu o expresie ridicată a acestei gene au fost utilizate pentru analiza metilării. Nivelul mediu de metilare în țesuturi cu o expresie scăzută a fost similar cu nivelul de metilare în țesuturi cu o expresie ridicată a fiecăreia dintre aceste gene. Nu a existat nicio corelație între nivelurile de expresie și metilare (Figura 4). În plus, nivelul mediu de metilare al fiecărei gene a fost similar în TVA și SAT. În cele din urmă, nivelurile medii de metilare ale genelor de interes au fost similare la pacienții obezi și slabi; cu toate acestea, numărul țesuturilor de la pacienții slabi a fost de numai 5, iar puterea statistică a acestei analize a fost scăzută.

Corelația expresiei ADRB2 (A), ADRB3 (B) , PARTEA 2 (C), THRA (D) și THRB (E) cu statutul de metilare al promotorilor lor. Punctele roșii reprezintă probe cu mare, în timp ce negru - cu expresie scăzută a genei investigate.

Discuţie

În această lucrare arătăm că expresia medie a mai multor gene legate de termogeneză este semnificativ mai mică în țesuturile adipoase provenite de la pacienții obezi decât în ​​țesuturile de la indivizi slabi. De asemenea, sugerăm că acest fenomen nu este probabil asociat cu metilarea diferențială a promotorilor lor.

Până în prezent, se știe puțin despre diferențele de activitate termogenă dintre TVA și SAT. Descoperirea că adipocitele „bej” sunt prezente predominant în SAT umană poate sugera rolul său dominant în termogeneză [40] și poate susține datele epidemiologice și experimentale care indică faptul că creșterea grăsimii subcutanate exercită un risc mai scăzut de complicații metabolice decât grăsimea viscerală analizată în [41] . Constatarea noastră că expresia PARTEA 2, ADRB2 și ADRB3 la subiecții obezi a fost semnificativ mai mic în TVA decât în ​​SAT ar putea indica un potențial lipolitic și termogen mai scăzut al TVA, coroborând studiile anterioare.

Concluzii

Din câte știm, dovezile pe care le prezentăm aici sunt primele care arată că țesuturile adipoase ale indivizilor obezi se caracterizează printr-o expresie scăzută a genelor cheie implicate în activarea termogenezei. Pe această bază, propunem că țesutul adipos al indivizilor obezi ar putea fi mai puțin reactivi atât la stimuli hormonali, cât și adrenergici și, prin urmare, mai puțin probabil să activeze termogeneza decât la subiecții slabi.