• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Contribuit de Harry J. Klee, 24 august 2016 (trimis spre revizuire 31 iulie 2016; revizuit de Richard M. Amasino și Graham B. Seymour)

Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Semnificaţie

Depozitarea la rece este utilizată pe scară largă pentru a prelungi durata de valabilitate a produselor agricole. Pentru tomate, această manipulare are ca rezultat o calitate a aromei redusă. Munca noastră oferă informații importante despre efectele răcirii asupra plăcerii consumatorilor, metabolomului aromatic și transcriptomului, precum și stării de metilare a ADN-ului. Transcrierile pentru unele enzime cheie de sinteză volatile și cei mai importanți factori de transcripție asociați maturării sunt mult reduse ca răspuns la răcire. Aceste reduceri sunt însoțite de modificări majore în starea de metilare a regiunilor promotor. Creșteri tranzitorii ale metilării ADN apar în timpul răcirii. Analiza noastră oferă o perspectivă asupra mecanismelor moleculare ale pierderii aromelor fructelor de roșii cauzate de răcire.

Abstract

Roșia comercială modernă este larg percepută ca lipsită de aromă și este o sursă majoră de nemulțumire a consumatorilor. Manipularea post-recoltare și sistemele de vânzare cu amănuntul contribuie major la o aromă slabă, în special practica frecvent utilizată a răcirii fructelor. Mulți consumatori depozitează fructele cumpărate în frigider, contribuind în continuare la deteriorarea aromelor (1). Aroma de roșii este produsă de o combinație de zaharuri, acizi și substanțe volatile (2, 3). Producția de substanțe volatile asociate aromelor este sensibilă la temperaturi sub 12 ° C și s-au observat pierderi de substanțe volatile în timpul depozitării la rece (4, 5). În schimb, substanțele chimice legate de gust, zaharurile și acizii nu sunt afectate în mod semnificativ de depozitarea la rece (6, 7).

Volatilele care conferă aromă sunt derivate din aminoacizi, acizi grași și carotenoizi, iar mai multe gene esențiale pentru sinteza lor au fost validate funcțional (8). De exemplu, volatilele C6 sunt sintetizate de o lipoxigenază, LoxC (9), hidroperoxid liasă (HPL) (10) și ALCOOL DEHIDROGENASE2 (ADH2) (11). Esterii volatili sunt sintetizați printr-o ALCOL ACETILTRANSFERAZĂ1 (AAT1) (12). DIOXIGENAZA CAROTENOIDĂ DE CLEAVAGE1 (CCD1) contribuie la sinteza apocarotenoidelor volatile (13). Sinteza multor volatili cu aromă de roșii crește în timpul coacerii fructelor. Mutanții de coacere, incolor non-coacere (Cnr) și non-coacere (nici) produc niveluri substanțial mai mici de volatile derivate din lipide decât de tip sălbatic (14). Unul dintre principalii factori de transcripție (TF) care mediază coacerea este INHIBITORUL DE COPIERE (RIN). Siturile de legare RIN sunt frecvent demetilate la coacere și legarea are loc împreună cu demetilarea (15), indicând faptul că starea de metilare a promotorului influențează expresia genelor dependente de RIN.

Analiza transcriptomică a identificat gene asociate cu răcirea fructelor de roșii. De exemplu, răcirea în 14 zile a fructelor Micro-Tom a dus la exprimarea diferențiată a multor gene legate de fotosinteză, metabolismul lipidelor, modificarea peretelui celular și producția de antioxidanți (16). Deși această lucrare a oferit informații despre expresia genelor induse de răcire, nu a abordat direct baza moleculară pentru pierderea aromelor volatile. Mai multe grupuri au analizat schimbările în activitatea LOX și volatile C6 ca răspuns la depozitarea frigorifică; producția redusă de substanțe volatile C6 nu poate fi explicată direct doar prin activitatea LOX (1, ​​5).

Aceste observații oferă un cadru pentru analiza mecanismului molecular care stă la baza pierderii aromelor de roșii induse de răcire. În plus față de impactul economic al pierderii calității aromelor, fructele de roșii oferă un sistem ideal în care să examineze efectele stresului asupra mediului la scară genomică. Aici, oferim o analiză cuprinzătoare a efectului răcirii asupra transcriptomului și metabolomului de aromă. Reprogramarea transcripțională mare care a avut loc ca răspuns la răcire și după o perioadă de recuperare a fost corelată cu modificări ale metilării ADN-ului.

Rezultate

Depozitarea frigorifică influențează volatilele legate de aromă.

Dinamica metilării ADN ca răspuns la răcire.

Analiza metilării ADN a fructelor Ailsa Craig ca răspuns la depozitarea la rece. (A) Modificarea ratei de metilare a citozinei în regiunile genice (dimensiunea coșului, 100 pb). Săgeata indică vârful de metilare la 300-400 bp în amonte de TSS; PAS, situs de poliadenilare. (B) Distribuția DMR-urilor în regiuni ale promotorilor de gene și corpuri (dimensiunea coșului, 100 pb). (C) Numărul de DMR și gene cu DMR în regiunile promotor din cele șase grupe definite în Fig. 2A. Procentul de DEG-uri cu DMR a fost reprezentat ca un raport între numărul de gene DMR și numărul de DEG-uri din fiecare grup prezentat în Fig. 2A. Grupurile A, B și C sunt gene ale căror transcrieri au fost reduse semnificativ prin depozitarea la rece, în timp ce grupurile D, E și F sunt gene induse de depozitarea la rece. (D) Corelarea metilării și a transcrierilor. Procentajul este numărul de gene cu corelație negativă între metilare și transcrieri împărțit la numărul total de gene din grup.

Au fost observate modele invers între transcrieri și nivelul de metilare pentru RIN și unele dintre țintele sale directe, inclusiv CNR, NOR, HPL1, ADH2 și AAT1 (15, 32); depozitarea la rece a crescut metilarea și a scăzut transcrierile (Fig. 5). Alte ținte RIN, cum ar fi HB-1, FUL1 și PSY1, au prezentat, de asemenea, un model similar (Anexa SI, Tabelul S8). Acest model nu era universal; LoxC, ACS4 și PG2a nu au prezentat acest model (Fig. 5). Deși nu putem atribui o relație de cauzalitate între modificările de metilare a citozinei și abundența transcriptului cu datele în mână, rezultatele indică în mod clar o modificare majoră a metilării ADN ca răspuns la stresul de răcire, adesea coincizând cu modificările de expresie ale genelor cunoscute pentru a contribui la maturarea fructelor și sinteză volatilă (Anexa SI, Fig. S9).

Nivelul de metilare și abundența de transcriere a genelor care interacționează cu RIN în fructele Ailsa Craig ca răspuns la depozitarea la rece. Linia neagră reprezintă nivelul de metilare. Linia albastră reprezintă abundența transcrierii.

DML2, care codifică ADM demetilaza de tip DEMETER, este puternic indus la debutul maturării fructelor și reprimarea sa a dus la hipermetilarea ADN-ului și la întârzierea substanțială a maturării (33). Prin urmare, am analizat expresia DML2 ca răspuns la răcire și recuperare ulterioară la 20 ° C. Nivelul redus al transcrierii DML2 a fost observat în timpul depozitării la rece, cu o creștere a fructelor transferate la 20 ° timp de 1 zi (apendicele SI, fig. S10), în concordanță cu modificările nivelurilor de metilare a citozinei genomului întreg. Ca atare, DML2 poate contribui atât la dezvoltarea, cât și la schimbările asociate cu răcirea metilării ADN-ului fructelor, cu efecte corespunzătoare atât asupra maturării generale a fructelor, cât și asupra caracteristicilor specifice de calitate, inclusiv volatilele asociate aromelor.

Discuţie

Deși soiurile moderne de roșii cu randament ridicat nu sunt la fel de aromate ca soiurile mai vechi (8), o parte semnificativă a problemei percepute la tomatele comerciale moderne poate fi atribuită răcirii post-recoltare (4). Expunerea la temperaturi de până la 4 ° C provoacă daune grave calității aromelor (1). Pentru a determina baza moleculară care stă la baza acelei deteriorări a aromei, am întreprins o analiză sistematică a fructelor expuse la temperatura de răcire, examinând modificările metabolomului aromei, transcriptomului și modificările modelelor de metilare a ADN-ului.

Răcirea nu a modificat conținutul de zahăr și acid din fructe (Fig. 1). Cu toate acestea, s-a observat o pierdere semnificativă a aromelor volatile la fructele depozitate la 5 ° C timp de 8 zile. Chiar și după o perioadă de recuperare de 1 zi la 20 ° C, compoziția volatilă a fost încă semnificativ mai mică decât în ​​fructele necongelate, rezultând o plăcere generală mai mică a consumatorilor. Doisprezece substanțe volatile au fost semnificativ modificate de depozitarea frigorifică în mai multe sezoane și soiuri. Am observat reduceri semnificative ale conținutului de substanțe volatile asociate cu căile C5/C6, aminoacizi cu lanț ramificat și ester (Fig. 1C). Aceste reduceri au fost corelate cu abundența transcriptă semnificativ mai mică a genelor ale căror produse sunt esențiale pentru sinteza lor. Deși conținutul transcript al unora dintre aceste gene a crescut după mutarea fructelor la temperatura camerei timp de 24 de ore, cele mai multe au rămas semnificativ mai mici decât în ​​fructele necongelate (Fig. 3). Spre deosebire de zaharuri și acizi, substanțele volatile sunt difuzabile în mod liber prin cicatricea tulpinii și trebuie completate în mod constant pentru a menține nivelurile adecvate în fructele recoltate. Deoarece expresia genelor care codifică enzimele biosintetice esențiale este semnificativ mai scăzută la 5 ° C, răcirea duce la epuizarea substanțelor volatile importante și la calitatea aromelor redusă.

Deși conținutul volatil total al fructelor a fost semnificativ mai mic în fructele răcite, un subgrup de arome volatile a crescut în timpul răcirii. Conținutul a două substanțe volatile derivate din scindarea licopenului, MHO și geranial, a fost mai mare după răcire (Fig. 3D și SI Anexa, Fig. S1B). Aceste substanțe volatile sunt produse prin scindarea oxidativă a licopenului, care reprezintă aproximativ 85% din cantitatea de carotenoizi dintr-un fruct copt (13, 34, 35). Scindarea poate fi fie enzimatică, catalizată de dioxigenaze de scindare carotenoidă, fie nonenzimatică. Transcriptul CCD1B este semnificativ mai scăzut la fructele răcite, la fel ca și transcrierile genelor de căi biosintetice ale carotenoidelor multiple (Fig. 3D și SI Anexa, Fig. S6). Cea mai probabilă explicație pentru creșterea conținutului de MHO și geranial este oxidarea carotenoidă neenzimatică indusă de răcire. Producția de specii reactive de oxigen este unul dintre principalele răspunsuri ale fructelor supuse unor stresuri abiotice, cum ar fi lumina și frigul ridicat, iar carotenoizii au fost raportați ca fiind principalii stingători ai oxigenului singlet (36, 37). Oxidarea nonenzimatică a carotenoizilor este principalul mecanism pentru producerea apocarotenoidelor volatile în Arabidopsis expuse la stres luminos ridicat (38).

Comparativ cu fructele coapte în ziua recoltării, analiza ARN-Seq a detectat 5.413 DEG în timpul depozitării la rece și 528 DEG după recuperarea la temperatura ambiantă (Anexa SI, Fig. S5A), indicând faptul că expresia multor gene este sensibilă la schimbarea temperaturii . O viziune globală a modificărilor transcripționale a arătat că metabolismul carbohidraților a fost semnificativ reglat în jos (Fig. 2A), indicând faptul că metabolismul energetic este suprimat în timpul depozitării la rece. Datele transcriptomilor noștri sunt în concordanță cu modificările descrise anterior de proteomi în fructele de roșii refrigerate, în care proteinele aparținând BIN-urilor de metabolism energetic au fost suprimate în mod semnificativ (7). Clasele funcționale asociate cu aminoacizii, acizii grași și metabolismul secundar au fost reduse prin depozitarea la rece urmată de o recuperare după transfer la 20 ° C.

În conformitate cu reprogramarea majoră a expresiei genelor în timpul răcirii, mai multe TF asociate cu dezvoltarea fructelor au prezentat abundența transcriptului modificată semnificativ ca răspuns la răcire (Fig. 3E). În special, TF-urile care sunt esențiale pentru maturare sunt scăzute, inclusiv RIN (39), NOR (40) și CNR (41). Exprimarea redusă a acestor TF ca răspuns la răcire ar fi de așteptat să reducă la nivel global multe procese asociate maturării, permițând organului să redirecționeze resursele metabolice către răspunsuri de stres mai adecvate. În plus față de aceste TF, transcrierile FUL1, o proteină de domeniu MADS care interacționează RIN, care afectează aspecte ale maturării, inclusiv sinteza volatilă (42), precum și HB-1, un regulator pozitiv al sintezei de etilenă (43), sunt scăzute în timpul răcirii . Exprimarea altor TF care reglementează aspecte specifice dezvoltării fructelor, inclusiv TAGL1 (44, 45) și AP2a (46, 47), a crescut în timpul răcirii. În special, AP2a este un regulator negativ al sintezei etilenei și al maturării fructelor. Astfel, o creștere a expresiei sale este în concordanță cu scăderea observată a expresiei genelor de sinteză a etilenei.

Răspunsul de răcire a roșiilor include, de asemenea, activatori transcripționali CBF. Transcrierile tuturor celor trei gene CBF (CBF1-3) au fost semnificativ crescute ca răspuns la răcire și au revenit la nivelurile bazale la revenirea la temperatura ambiantă (Fig. 2B). Comparația anterioară a acțiunii CBF la tomate a indicat faptul că regulonul CBF al tomate este considerabil mai mic decât omologul său Arabidopsis (21). Am examinat expresia indusă de înghețare a tuturor celor mai apropiați omologi ai regulonului Arabidopsis. Regulonul Arabidopsis este format din 133 de gene reglate în sus și 39 de gene reglate în jos (22). Dintre cele 172 de gene combinate, 27 au prezentat o expresie semnificativ diferită în timpul răcirii și că expresia diferențială a fost adesea în direcția opusă ca în Arabidopsis (Anexa SI, Tabelul S4). Astfel, deși există un răspuns asociat CBF la răcire, acel răspuns este substanțial diferit de Arabidopsis tolerant la răcire.

În concluzie, am demonstrat că răcirea fructelor de roșii coapte are ca rezultat o calitate a aromei redusă semnificativ. Această reducere este asociată cu modificări majore ale conținutului de substanțe volatile asociate cu placerea consumatorilor. Nivelurile reduse de substanțe volatile specifice sunt asociate cu niveluri foarte reduse de transcrieri pentru unele enzime cheie de sinteză volatile. Exprimarea genelor care codifică TF-uri care sunt esențiale pentru maturare, inclusiv RIN, NOR și CNR, sunt, de asemenea, reduse ca răspuns la răcire și pot fi responsabile pentru niveluri reduse de transcriere în numeroasele gene în timpul răcirii. Aceste reduceri sunt însoțite de schimbări majore în starea de metilare a promotorilor, inclusiv cele ale TF-urilor menționate mai sus, și pot contribui la fidelitatea expresiei genice necesare pentru a oferi un răspuns maxim benefic la mediu cu o influență tangențială minimă asupra biologiei mai largi a dezvoltării fructelor.

Materiale și metode

Tratament cu fructe de roșii.

Roșiile au fost cultivate într-o seră din campusul Universității din Florida. Fructele în stadiul complet roșu copt, fără defecte vizuale și dimensiuni uniforme au fost selectate, spălate cu apă și uscate la aer. Roșiile au fost împărțite în trei grupe: (i) depozitate la 5 ° C cu 92% umiditate relativă timp de 7 zile și apoi transferate la 20 ° C pentru recuperare de 1 zi; (ii) menținut la 5 ° C timp de 8 zile fără recuperare la temperatura ambiantă; și (iii) fructe în ziua recoltării ca martori. Primele două grupuri au fost recoltate cu 8 zile înainte de al treilea grup, iar fructele au fost supuse testului consumatorului în ziua celei de-a treia recolte.

Analiza testelor de consum.

Toate testele pentru consumatori au fost aprobate de către Consiliul de revizuire instituțională al Universității din Florida. Panourile gustative erau formate din 76 de persoane. Panelistii au apreciat gustul general al tomatelor Ailsa Craig refrigerate și neînfrăcite folosind o scară de mărime etichetată general hedonică, așa cum s-a descris anterior (3). Roșiile răcite au fost mai puțin plăcute decât roșiile răcite atunci când scorurile de apreciere ale paneleniștilor au fost comparate ca perechi potrivite folosind un test t cu o singură coadă, testul semnelor sau testul de rang semnat Wilcoxon. După măsurarea calității aromelor, țesutul pericarpian a fost înghețat în azot lichid și depozitat la -80 ° C până la analiza zahărului și a acidului.

Analiza producției de etilenă.

Fructele au fost sigilate în recipiente de 500 ml timp de 1 oră și 1 ml de probe de gaz de spațiu principal au fost analizate folosind un cromatograf de gaz HP5890 seria II (Hewlett Packard) echipat cu un detector de ionizare cu flacără. Programul de temperatură a fost 110 ° C pentru cuptor, 110 ° C pentru orificiul de injecție și 130 ° C pentru detector.

Analiza volatilă.

Analiza volatilă a fost efectuată conform metodei descrise anterior (48), cu trei replici biologice a câte șase fructe grupate fiecare. Roșiile coapte tocate au fost închise în tuburi de sticlă care curg cu aer filtrat timp de 1 oră, iar substanțele volatile au fost extrase folosind o coloană Super Q. Volatilele au fost eluate cu clorură de metilen folosind acetat de nonil ca control intern și separate pe un cromatograf de gaz Agilent 6890N echipat cu o coloană DB-5 (Agilent). Timpii de retenție au fost comparați cu standardele autentice, iar conținutul volatil a fost calculat ca ng⋅g −1 greutate proaspătă (FW) h -1 .

Analiza zaharurilor și a acizilor.

Conținutul de glucoză, fructoză, acid malic și acid citric a fost determinat așa cum s-a descris anterior (35). Analiza a fost efectuată pe trei replici biologice, fiecare constând din șase fructe.

Izolarea ARN-ului și secvențierea de mare viteză.

ARN-ul a fost extras folosind un kit RNeasy Mini (Qiagen) urmând instrucțiunile producătorului, iar calitatea a fost monitorizată prin electroforeză pe gel și A260/A280. Bibliotecile pentru ARN-Seq specific cu catenă Illumina cu randament ridicat au fost preparate așa cum s-a descris anterior (49). Au fost pregătite trei replici biologice pentru fiecare tratament, fiecare constând din fructe combinate multiple. Statisticile privind calitatea secvențierii și datele de corelație au ilustrat relația relativă globală dintre replicatele biologice și printre probele de fructe sunt prezentate în anexa SI, tabelele S10 și S11.

Secvențierea ADN-ului.

Secvențierea ADN-ului Illumina a fost efectuată pe un HiSeq2500 folosind reactivi și protocoale furnizate de Illumina, alinierea la genomul de referință al tomatei (v2.40) și determinarea expresiei pentru fiecare genă au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (17).

Metilarea ADN-ului.

ADN-ul genomic a fost extras folosind un kit mini Qiagen DNeasy Plant (https://www.qiagen.com/us), iar calitatea a fost monitorizată prin electroforeză pe gel și un raport de A260/A280. Conversia bisulfitului ADN-ului genomic al tomatei și secvențierea Illumina au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (15). Toate datele metilomului legate de răcire generate pentru această lucrare sunt arhivate la rezoluție cu o singură bază în baza de date cu epigenom de tomate la ted.bti.cornell.edu/epigenome/.

Analize statistice.

Emisiile volatile au fost supuse analizei ANOVA unidirecționale (OriginPro 9.0, Microcal Software). PCA a fost selectat pentru a oferi o imagine de ansamblu asupra schimbărilor în volatilele detectate și a modelelor globale de expresie genică ca răspuns la depozitarea la rece (www.metaboanalyst.ca). DEG-urile au fost definite prin citiri per kilobază per milion (RPKM) fold-change> 2 și FDR 1 Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: hjkleeufl.edu .

pierderea