Abstract

fundal

Golirea gastrică este afectată la pacienții cu gastropareză, în timp ce este fie neschimbată, fie accelerată la persoanele obeze. Scopul studiului actual a fost de a identifica modificările exprimării genelor la nivelul stomacului muscular care pot contribui la modificarea motilității gastrice în gastropareza idiopatică și obezitate.

Metode

RT-PCR cantitativ în timp real și secvențierea transcriptomului întreg au fost folosite pentru a compara transcriptomii indivizilor slabi, indivizilor obezi și indivizilor slabi sau obezi cu gastropareză idiopatică.

Rezultate

Obezitatea duce la o creștere a ARNm asociate cu contractilitatea musculară, în timp ce gastropareza idiopatică duce la o scădere a ARNm asociate cu semnalizarea PDGF BB. Atât obezitatea, cât și gastropareza idiopatică au fost, de asemenea, asociate cu modificări similare ale căilor asociate cu inflamația.

Concluzii

Rezultatele noastre arată că obezitatea și gastropareza idiopatică duc la modificări suprapuse, dar distincte, ale transcriptomului muscularului gastric. Exprimarea crescută a ARNm care codifică proteinele contractile ale mușchiului neted poate contribui la motilitatea gastrică crescută observată la subiecții obezi, în timp ce semnalizarea scăzută a PDGF BB poate contribui la motilitatea afectată observată la subiecții cu gastropareză idiopatică.

fundal

Metode

Evaluare clinică

Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu protocolul aprobat de Consiliul de revizuire instituțională a Universității Indiana. Au fost obținute consimțământuri informate de la subiecții martor și pacienții cu gastropareză idiopatică. Gastropareza idiopatică a fost definită ca pacienți cu simptome de gastropareză ≥ 3 luni cu golire gastrică întârziată prin scintigrafie gastrică de 4 ore sau prezența unui bezoar gastric cu alimente nedigerate prin endoscopie superioară după un post peste noapte. Scintigrafia gastrică a fost efectuată după consumul unei mese cu albuș de ou cu conținut scăzut de grăsimi, cu imagistica la 0, 2 și 4 ore, după cum sa descris anterior [18, 19]. Golirea gastrică anormală a fost definită ca retenție de 2 ore ≥60% sau retenție de 4 ore ≥10%. Pacienții cu gastropareză incluși în studiu nu au avut diabet zaharat, determinat de glucoza de post normală sau hemoglobina normală A1c (HbA1c) prin test de sânge. Am exclus, de asemenea, subiecții cu alte boli sistemice, cum ar fi intervenția chirurgicală cu traume vagale, sclerodermia, tulburarea mixtă a țesutului conjunctiv și sindromul paraneoplazic.

Biopsii stomacale cu grosime completă

Biopsii din grupul de control al IMC scăzut (fără diabet raportat sau gastropareză) au fost obținute de la donatori de transplant de organe în momentul transplantului de organe. Biopsiile din grupul de control al IMC ridicat au fost obținute de la indivizi nediabetici fără simptome gastropareze care au fost supuși unei intervenții chirurgicale de scădere în greutate bariatrică (nivel normal de HbA1c 7. Nivelurile de ATP4A și gastrin mRNA au fost analizate în toate probele prin qRT-PCR pentru a depista contaminarea mucoasei Pentru analize ulterioare au fost utilizate numai probele care au avut niveluri de expresie ale acestor markeri care au fost de mai puțin de 100 de ori mai mici decât nivelurile prezente în mucoasă.

Pregătirea și secvențierea bibliotecii

Concentrația și calitatea probelor totale de ARN au fost evaluate mai întâi utilizând Agilent 2100 Bioanalyzer. Un RIN (RNA Integrity Number) de 7 sau mai mare a fost necesar pentru a trece controlul calității. Apoi, 200 ng de ARN pe probă au fost folosite pentru a prepara o bibliotecă de ADNc cu catenă specifică dublă indexată utilizând KAPA mRNA Hyperprep Kit (Roche). Bibliotecile rezultate au fost evaluate pentru distribuția cantității și dimensiunilor lor folosind Qubit și Agilent 2100 Bioanalyzer. Au fost utilizate două sute de biblioteci pico molare grupate pe celulă de flux pentru amplificarea clusterelor pe cBot folosind HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit și secvențiate cu o configurație asociată de 2,75 bp pe HiSeq4000 (Illumina) folosind HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit. Un scor de calitate Phred (scor Q) a fost utilizat pentru a măsura calitatea secvențierii. Mai mult de 90% din citirile secvențiale au atins Q30 (99,9% acuratețea apelului de bază). Secvențierea a fost efectuată în Centrul de Genomică Medicală (CMG) de la Școala de Medicină a Universității Indiana, o unitate de bază de secvențiere a Indiana CTSI.

Alinierea secvenței și numărul de gene

Datele de secvențiere au fost evaluate mai întâi folosind FastQC (Babraham Bioinformatics, Cambridge, Marea Britanie) pentru controlul calității. Apoi toate bibliotecile secvențiate au fost mapate la genomul uman (UCSC hg38) folosind alinierea STAR RNA-seq [20] cu următorul parametru: „--outSAMmapqUnique 60”. Distribuția citirilor în genom a fost evaluată folosind bamutils (de la ngsutils) [21]. Citirile secvențiale mapate unic au fost atribuite genelor refgene hg38 folosind featureCounts (din subcitire) cu următorii parametri: „-s 2 –p –Q 10” [22]. Controlul calității rezultatelor secvențierii și mapării a fost rezumat folosind MultiQC [23]. Au fost păstrate gene cu număr citit per milion (CPM)> 0,5 în mai mult de 4 dintre probe. Datele au fost normalizate utilizând metoda TMM (media tăiată a valorilor M). Numărul mediu de citiri cartografiate în mod unic obținute pe eșantion a fost de 28,7 milioane (86,96% din lecturile brute), cu un minim de 22,3 milioane și un maxim de 32 de milioane. Analiza expresiei diferențiale a fost efectuată folosind edgeR [24, 25]. Rata de descoperire falsă (FDR) a fost calculată din p-valorile folosind procedura Benjamini-Hochberg. Datele complete de secvențiere a ARN sunt disponibile din baza de date NCBI GEO, numărul de acces GSE129398.

qRT-PCR. 500 ng de ARN au fost utilizate în reacțiile de transcripție inversă (trusă de înaltă capacitate RT-cDNA, Life Technologies). PCR în timp real a fost efectuat folosind Sybr Green (Roche). Nivelurile de expresie a ARNm au fost normalizate la expresia proteinei de legare TATA (TBP) ca un control intern și sunt exprimate în raport cu valorile medii observate în probele de la pacienții cu IMC scăzut de control. Primerii utilizați pentru qRT-PCR sunt enumerați în fișierul suplimentar 4: Tabelul S1

analize statistice

S-au identificat diferențe semnificative între grupuri utilizând analiza Anova într-un mod cu un test Kruskal-Wallis și un post-test Duns Multiple Comparation.

Rezultate

Subiecții obezi au markeri ICC crescuți, dar nu s-au modificat markerii fibroblastelor PDGFRα pozitive comparativ cu subiecții cu IMC scăzut

transcriptomului

Creșterea mRNA KIT și ANO1 la subiecții obezi, scăderea mRNA PDGFRα și PDGFB la subiecții cu gastropareză. ARN total a fost izolat din stratul muscular al biopsiilor obținute de la 9 subiecți martor cu IMC scăzut, 10 subiecți martori cu IMC ridicat și 13 subiecți cu gastropareză idiopatică și IMC scăzut. qRT-PCR a fost utilizat pentru a măsura expresia fiecăruia dintre mARN-urile indicate. Datele prezentate au fost normalizate la un control intern care codifică TBP și sunt exprimate în raport cu nivelurile din controlul subiecților cu IMC scăzut. Expresie relativă = 2 -ΔΔCt, unde ΔΔCt = (CtHMI mare sau Gastroparesis-CtTBP) - (CtLow BMI control-CtTBP). Fiecare punct reprezintă un subiect individual. Se indică, de asemenea, media ± SEM. S-au identificat diferențe semnificative între grupuri folosind analiza Anova unidirecțională cu un test Kruskal-Wallis și un post-test Duns Multiple Comparation

ARNm care codifică unele proteine ​​contractile ale mușchiului neted au fost crescute atât la subiecții obezi, cât și la subiecții cu gastropareză

Spre deosebire de scăderile raportate anterior ale expresiei ARNm care codifică unele proteine ​​contractile la subiecții cu gastropareză idiopatică comparativ cu subiecții cu control IMC ridicat [9], în comparație cu controalele donatorului cu transplant de IMC scăzut, subiecții cu gastropareză idiopatică au avut niveluri ridicate de ARNm care codifică MYH11, ACTA2 și MYLK1 (Fig. 2). Interesant este că mARN-urile MYH11, MYLK1 și ACTAG2 au fost, de asemenea, semnificativ crescute la subiecții cu un control IMC ridicat, comparativ cu subiecții cu un control scăzut al IMC, acest lucru a fost însoțit de o creștere semnificativă a mARN-ului SRF (Fig. 2). Această creștere în grupul de control al IMC ridicat ar putea explica rezultatele noastre anterioare ale expresiei scăzute a acestor ARNm la subiecții cu gastropareză idiopatică în comparație cu subiecții cu control al IMC ridicat [9].

ARNm care indică mușchiul neted contractil sunt crescute în musculatura subiecților obezi și la subiecții cu gastropareză. ARN total a fost izolat din stratul muscular al biopsiilor obținute de la 9 subiecți martor cu IMC scăzut, 10 subiecți martori cu IMC ridicat și 13 subiecți cu gastropareză idiopatică și IMC scăzut. qRT-PCR a fost utilizat pentru a măsura expresia fiecăruia dintre mARN-urile indicate. Datele prezentate au fost normalizate la un control intern care codifică TBP și sunt exprimate în raport cu nivelurile din controlul subiecților cu IMC scăzut. Expresie relativă = 2 -ΔΔCt, unde ΔΔCt = (CtHMI mare sau Gastroparesis-CtTBP) - (CtLow BMI control-CtTBP). Fiecare punct reprezintă un subiect individual. Se indică, de asemenea, media ± SEM. S-au identificat diferențe semnificative între grupuri folosind analiza Anova unidirecțională cu un test Kruskal-Wallis și un post-test Duns Multiple Comparation

Obezitatea și gastropareza sunt asociate cu transcriptome musculare gastrice distincte, dar suprapuse

Pentru a începe să identificăm care modificări ale expresiei ARNm au fost asociate cu gastropareza, spre deosebire de obezitate, am comparat mai întâi gene exprimate diferențial în fiecare grup, așa cum se arată în Fig. 4. Genele exprimate diferențial au fost analizate în două moduri diferite, în primul, modificările log2 ori au fost calculate pe toate eșantioanele față de eșantioanele cu IMC scăzut, seturile de gene rezultate au fost apoi filtrate pentru a elimina genele situate pe cromozomul Y. Într-o a doua abordare, probele au fost comparate numai cu alte probe obținute de la subiecți de același sex (Fișă suplimentară 6: Tabelul S3) Genele exprimate diferențial au fost apoi filtrate la cele care prezintă un logFC de - 1 sau mai puțin sau de + 1 sau mai mare cu un FDR de 2 ori, FDR Fig. 4

Genele prevazute cu PDGF BB sunt reglementate în jos la subiecții cu gastropareză. În concordanță cu datele qRT-PCR prezentate în Fig. 1b, Analiza căii de ingeniozitate a arătat că semnalizarea PDGF BB poate fi modificată la subiecții cu gastropareză (Fig. 4 și fișierul suplimentar 7: Tabelul S4). ARN total a fost izolat din stratul muscular al biopsiilor obținute de la 9 subiecți martor cu IMC scăzut, 10 subiecți martori cu IMC ridicat și 13 subiecți cu gastropareză idiopatică și IMC scăzut. qRT-PCR a fost utilizat pentru a verifica unele dintre aceste modificări în mARN-urile dependente de PDGF BB. Datele prezentate au fost normalizate la un control intern care codifică TBP și sunt exprimate în raport cu nivelurile din controlul subiecților cu IMC scăzut. Expresie relativă = 2 -ΔΔCt, unde ΔΔCt = (CtHMI mare sau Gastroparesis-CtTBP) - (CtLow BMI control-CtTBP). Fiecare punct reprezintă un subiect individual. Se indică, de asemenea, media ± SEM. S-au identificat diferențe semnificative între grupuri folosind analiza Anova unidirecțională cu un test Kruskal-Wallis și un post-test Duns Multiple Comparation

Analiza căilor celor 209 mARN-uri împărțite între grupul de control al IMC ridicat și grupurile de gastropareză IMC scăzut sau ridicat au relevat o îmbogățire a căilor asociate cu activarea LXR/RXR, în plus față de cele asociate cu aderența granulocitelor și diapedeza, ateroscleroza și osteoartrita (HiC și HiG sau LoG; Fig. 6). Interesant este că cel mai îmbogățit activator din amonte din acest grup a fost SP1. Deoarece obezitatea a fost raportată a fi asociată cu o rată crescută de golire gastrică în comparație cu scăderea golirii gastrice caracteristice gastroparezei am emis ipoteza că, dacă genele din acest grup comun sunt legate de golirea gastrică, atunci acestea pot fi afectate în mod opus în obezitate și gastropareză. subiecte. Cu toate acestea, am constatat că aproape toate genele din acest grup comun au fost afectate în mod similar atât de obezitate, cât și de gastropareză, sugerând că este puțin probabil ca acestea să fie direct legate de golirea gastrică (Fig. 7).

Atât obezitatea, cât și gastropareza au efecte similare asupra unui grup de gene. Sunt indicate modificări relative în expresia setului comun de ARNm a căror expresie a fost modificată semnificativ la subiecții martor cu IMC ridicat (HiC) și la subiecții cu gastropareză cu IMC scăzut (LoG) sau ridicat (HiG) (grupul, LoG și HiG și HiC sunt indicate) din 138 de gene prezentate în Fig. 6)

Modificări ale transcriptomului asociate cu gastropareza, indiferent de IMC-ul subiecților de control

Discuţie

Rezultatele studiului nostru arată că obezitatea are ca rezultat modificări ale expresiei mARN-ului în musculatura gastrică, care reflectă expresia crescută a markerilor ICC și a celulelor musculare netede și o scădere generală a expresiei genelor asociate cu inflamația (figurile 1 și 2). De asemenea, am observat o creștere a mARN-urilor care codifică proteinele contractile în musculatura gastrică a subiecților cu gastropareză idiopatică și am confirmat scăderile raportate anterior ale ARNm asociate cu fibroblaste PDGFRα-pozitive la acești subiecți (figurile 1 și 2). Semnalizarea modificată a PDGF BB a fost sugerată în continuare din analiza noastră de secvențiere a ARN-ului, care a dezvăluit PDGF BB ca un regulator anticipat în amonte al multora dintre mARN-urile a căror expresie a fost scăzută în mod specific la subiecții cu gastropareză idiopatică (Fig. 4 și 6, fișier suplimentar 7: Tabelul S4) .

Concluzii

Rezultatele studiului nostru sugerează că ar putea fi mai bine să se utilizeze subiecții martori identici cu IMC atunci când investighează modificările patologice care apar în timpul gastroparezei idiopatice. Datele sugerează că obezitatea singură poate induce modificări ale musculaturii stomacului care cresc motilitatea și afectează inflamația. Analiza sugerează că semnalizarea modificată a PDGF BB poate acționa împreună cu căile inflamatorii disfuncționale în patogeneza gastroparezei idiopatice.