• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: liuy @ sibs.ac.cncai_li @ merck.com

ABSTRACT

Leptina reglează homeostazia energetică prin activarea centrală a mai multor căi de semnalizare mediate de Ob-Rb, forma lungă a receptorului de leptină. Rezistența la leptină stă la baza dezvoltării patogene a obezității, care este strâns asociată cu factorii de mediu. Pentru a înțelege în continuare funcția fiziologică a mecanismelor de semnalizare a leptinei, am generat o linie knock-in de șoareci (Y985F) care exprimă un Ob-Rb mutant cu o substituție fenilalanină pentru Tyr 985, una dintre cele trei tirozine intracelulare care mediază acțiunile de semnalizare ale leptinei. În mod surprinzător, în timp ce animalele tinere homozigote Y985F erau ușor mai slabe, acestea prezintă obezitate la adulți sau indusă de dietă. Important, atât deteriorarea echilibrului energetic dependent de vârstă, cât și cea indusă de dietă a fost paralelă cu rezistența pronunțată la leptină, care a fost atribuită în mare măsură atenuării activării STAT3 hipotalamice receptive la leptină, precum și expresiei ridicate în mod vizibil a SOCS3 hipotalamic, un regulator negativ cheie al leptinei semnalizare. Astfel, aceste rezultate demască roluri binare distincte pentru semnalizarea mediată de Try 985 în metabolismul energetic, acționând ca un comutator de reglementare dependent de vârstă/dietă pentru a contracara obezitatea asociată vârstei sau indusă de dietă.

semnalizarea

Pentru a obține o perspectivă suplimentară asupra rolurilor fosforilării intracelulare a tirozinei Ob-Rb în medierea funcțiilor fiziologice ale leptinei in vivo, am generat anterior două linii de șoareci care exprimă receptori mutanți de leptină cu substituție fenilalanină pentru toate cele trei tirozine sau doar pentru Tyr 1138, dezvăluind contribuția metabolică atât a acțiunilor dependente de tirozină, cât și a acțiunilor independente în homeostazia energetică (26). Aici am investigat consecințele fiziologice ale semnalării abrogării prin Ob-Rb Tyr 985 prin caracterizarea șoarecilor knock-in generați prin introducerea unei mutații de substituție a fenilalaninei la acest sit. Am examinat impactul deficienței în semnalizarea mediată de Tyr 985 asupra susceptibilității șoarecilor la dezechilibrul energetic asociat vârstei și indus de dietă, încercând să explorăm potențialele legături mecanistice dintre rezistența la leptină și influențele mediului, precum îmbătrânirea și supranutriția.

MATERIALE ȘI METODE

Generație de șoareci Y985F knock-in. Strategia de direcționare a genei pentru generarea șoarecilor knock-in (Y985F) care exprimă receptorul mutant al leptinei Ob-Rb F985 a fost efectuată la Centrul de Tehnologie Transgenică din UTSW așa cum s-a descris anterior în detaliu (26). Pe scurt, vectorul de țintire a fost construit prin introducerea Lox-Neo-Lox (LNL), gena de rezistență la neomicină flancată în lox, în aval de exonul mutant 18 al genei Ob-Rb, care conține mutația de substituție țintită la Tyr 985 (Fig. 1A). Clone recombinante stabile omoloage au fost selectate cu G418 din celule stem embrionare 129/Sv (ES) transfectate cu constructul de ADN țintit, urmată de confirmarea substituției Tyr-la-Phe prin analiza secvențială a fragmentelor de ADN de exon amplificat cu PCR 18 . Blastocistii injectați cu clonele ES confirmate au fost ulterior transferate la femele pseudopregnant pentru a produce șoareci agerici himerici, iar direcționarea genică cu succes a fost confirmată în continuare prin Southern blot. Șoarecii knock-in transmiși cu linia germinală au fost încrucișați cu șoareci protamin-Cre, îndepărtând caseta de selecție LNL doar din linia germinativă masculină.

Analiza fenotipică. Grăsimea corporală totală a fost măsurată prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) utilizând un analizor Minispec Mq7.5 (Bruker, Germania). Consumul de alimente a fost determinat de la șoareci cuști individual, cântărind zilnic mâncarea înainte de ciclul de întuneric timp de 5 până la 10 zile. Rapid (6 ore de post, 8:30 a.m. până la 2:30 p.m.) s-a colectat sânge din vena cozii, iar glucoza a fost măsurată folosind un glucometru (FreeStyle, Alameda, CA). Nivelurile de insulină și leptină au fost analizate cu serul de șoarece Adipokine LINCOplex Kit (Linco Research, St. Charles, MO) utilizând sistemul Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, California) conform instrucțiunilor producătorului.

Rata metabolică și activitatea fizică. Consumul de oxigen și activitatea fizică au fost determinate pentru animalele hrănite ad libitum utilizând sistemul cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH) conform instrucțiunilor producătorului. Șoarecii au fost lăsați să se acomodeze cu sistemul timp de 16 până la 20 de ore, iar absorbția de oxigen (VO2) a fost măsurată pentru următoarele 24 de ore. Activitatea voluntară a fost monitorizată din pauzele fasciculului axei x colectate la fiecare 15 minute.

Test de sensibilitate la leptină in vivo. Șoarecii masculi la vârsta de 7 sau 40 de săptămâni au fost injectați intraperitoneal (ip) de două ori pe zi (la 8:30 și 18:00) cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau leptină recombinantă de șoarece (National Hormone and Peptide Program, UCLA, Torrance, CA) (1 mg/kg/zi pentru șoareci de 7 săptămâni și 2,5 mg/kg/zi pentru șoareci de 40 de săptămâni). Șoarecii au fost mai întâi injectați cu PBS timp de 3 zile, urmat de injecție cu leptină timp de 3 până la 4 zile după cum s-a indicat și apoi injecție cu PBS pentru alte 2 zile. Greutatea corporală și consumul de alimente au fost monitorizate zilnic în timpul tratamentului.

Transcriere inversă cantitativă în timp real-PCR (RT-PCR). ARN hipotalamic total a fost izolat utilizând reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). După tratamentul cu DNază I fără RNază (Roche Applied Science, Penzberg, Germania), ADNc din prima catenă a fost sintetizat cu transcriptază inversă a virusului leucemiei murine Moloney (M-MLV) și primeri hexameri aleatori (Invitrogen). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7500, urmând recomandările producătorului (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primerii oligonucleotidici utilizați pentru fiecare genă țintă analizată au fost după cum urmează: pentru Ob-Rb, 5'-CCTCCAGGAGAGATGCTCACAC-3 'și 5'-TGACTGTGCGTGGAACAGGT-3'; pentru ciclofilină, 5'-ATGGCAAATGCTGGACCAAA-3 'și 5'-CATGCCTTCTTTCACCTTCCC-3'; pentru neuropeptida Y (NPY), 5'-TCCGCTCTGCGACACTACAT-3 'și 5'-GGCGTTTTCTGTGCTTTCCT-3'; pentru proteina asociată cu Agouti (AgRP), 5'-GCTGTGTAAGGCTGCACGAG-3 'și 5'-TCCATTGGCTAGGTGCGACT-3'; pentru pro-opiomelanocortină (POMC), 5'-AAGATGCCGAGATTCTGCTACA-3 'și 5'-GGGCTGTTCATCTCCGTTG-3'; pentru SOCS3, 5'-GCGAGAAGATTCCGCTGGTA-3 'și 5'-TACTGATCCAGGAACTCCCGA-3'; pentru SHP2, 5'-CAAGTGCAACAATTCCAAACC-3 'și 5'-AACACGCATGACCCCGTA-3'; pentru PTP1b, 5'-TGGCCACAGCAAGAAGAAAA-3 'și 5'-GGAAAGGCAGGATCTCTGA-3'; și pentru SH2B, 5′-GAAGCAGCCACAGGATCGTT-3 ′ și 5′-CCTTGCCCTGGAAGTTGA-3 ′.

Șoarecii heterocigoti Y985F dezvoltă grade moderate de adipozitate cu debut tardiv. (A și B) Greutatea corporală (A) și conținutul de grăsime (B) au fost măsurate pentru animalele WT masculin și feminin, heterozigoți Y985F/+ și animale homozigoți Y985F/Y985F la vârsta de 7 ani față de 51 săptămâni (n> 8 per grup). (C) Nivelurile de expresie ale mRNA Ob-Rb în hipotalamus au fost determinate prin RT-PCR cantitativă pentru șoareci femele la 7 față de 55 săptămâni în starea hrănită (n = 5 sau 6 per grup). Toate valorile reprezintă media ± SEM. *, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Parametrii serici ai șoarecilor Y985F și ai coechipierilor WT la o vârstă tânără versus o vârstă înaintată

Șoarecii Y985F sunt predispuși la obezitate indusă de dietă bogată în grăsimi după vârsta cu niveluri de adipozitate similare. Șoarecii masculi WT și șoareci homozigoti Y985F au fost hrăniți cu chow normal (NC) până la vârsta de 15 săptămâni, la care ambele genotipuri au prezentat niveluri de adipozitate similare. Animalele au fost apoi provocate cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) versus NC timp de 13 săptămâni. (A și B) Greutatea corporală (A) și conținutul de grăsime (B) au fost monitorizate (grup NC, n = 6 până la 8; grup HFD, n> 10) și sunt prezentate ca medii ± SEM. **, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Parametrii serici ai șoarecilor Y985F și ai coechipierilor WT hrăniți cu NC versus HFD a

Am investigat apoi dacă un aport alimentar ridicat de grăsime ar putea accelera apariția obezității la adulți la șoarecii Y985F. Spre deosebire de șoarecii l/l raportați, în care mutația Tyr 985 la un reziduu de leucină a dus la protecția animalelor de sex feminin împotriva obezității induse de HFD la vârsta de 5 până la 12 săptămâni (10), șoarecii masculi Y985F homozigoti hrăniți cu HFD la vârsta de 5 săptămâni a arătat o accelerare susținută a creșterii în greutate corporală față de șoarecii hrăniți cu NC, atingând greutăți corporale și niveluri de adipozitate la vârsta de 9 săptămâni, care au fost similare cu cele de la colegii de litiere WT potrivite pentru vârstă (Fig. 8A și B). Mai mult, șoarecii Y985F hrăniți cu HFD au arătat o creștere în greutate corporală care depășește cea a șoarecilor WT cu 7,4 până la 11,3 g (Fig. 8A) și au acumulat cu 13% mai multă grăsime corporală (Fig. 8B) la vârsta de 15 până la 19 săptămâni, afișând mai mult obezitate pronunțată indusă de dietă (Fig. 8C). Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că deficitul de semnalizare Tyr 985 amplifică afectarea metabolică indusă de HFD în controlul energiei, sugerând că Ob-Rb Tyr 985 exercită acțiuni metabolice importante care contracarează efectele unui aport alimentar ridicat de grăsimi.

Similar cu cazul animalelor obeze Y985F adulte, evaluarea cantitativă RT-PCR nu a evidențiat modificări proeminente în expresia ARNm a neuropeptidelor AgRP, NPY sau POMC în hipotalamia șoarecilor femele Y985F hrănite cu HFD timp de 15 săptămâni, care au prezentat în mod similar exacerbate adipozitatea indusă de dietă în raport cu colegii lor de WT (Fig. 9A și B). Pe de altă parte, în paralel cu creșterea observată indusă de HFD la nivelurile bazale de fosforilare STAT3, hrănirea HFD la animalele Y985F a condus la o creștere semnificativă a expresiei mRNA hipotalamice a SOCS3 (de ± 1,5 ori) în comparație cu șoarecii WT (Fig. 9C). Aceste rezultate sugerează astfel că pierderea acțiunilor mediată de Tyr 985 poate conferi o susceptibilitate crescută la dereglarea echilibrului energetic dependent de vârstă și indusă de dietă prin mecanisme similare, prin care exprimarea crescută a SOCS3 poate contribui în mare parte la apariția rezistenței la leptină.

În ciuda faptului că mecanismele precise prin care abundența crescută de SOCS3 în hipotalamus perturbă acțiunile metabolice ale leptinei nu au fost încă descifrate, SOCS3 își poate exercita efectele antagonizante prin blocarea activităților nucleare sau mitocondriale ale proteinei STAT3 (23, 40), mai degrabă decât prin inhibarea directă a fosforilării STAT3 (5, 24). Mai mult, semnalizarea deficitară Tyr 985 a dus la apariția adulților sau a dezechilibrului energetic indus de dietă la șoarecii Y985F în absența expresiei proeminent nereglate a neuropeptidelor NPY/AgRP sau POMC hipotalamice. Astfel, semnalizarea prin Tyr 985 poate fi capabilă să-și exercite in vivo efectele metabolice prin mecanisme independente de reglarea expresiei acestor neuropeptide, în special acționând prin neuroni receptivi la leptină în regiunile hipotalamice în afară de ARC.

Receptorul leptinei folosește o multitudine de căi de semnalizare mediate de tirozil-fosforilare pentru a exercita funcțiile metabolice ale leptinei. Se consideră că alte componente cheie, cum ar fi fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) (35), AMP kinaza (AMPK) (30) și mTOR (13), sunt implicate în medierea controlului central al leptinei asupra metabolismului energetic. Cu toate acestea, modul în care mecanismele complexe de semnalizare Ob-Rb funcționează sub diferite influențe de mediu rămâne puțin înțeles. Aici, rezultatele noastre relevă conexiunea funcțională a unui braț de semnalizare a Ob-Rb prin Tyr 985 la influențele metabolice exercitate de îmbătrânire și supranutriție în controlul echilibrului energetic. Deoarece rezistența la leptină este strâns asociată cu forma obișnuită a obezității umane la adulți în contextul îmbătrânirii sau al consumului de alimente cronice cu energie ridicată, descoperirile noastre demască un potențial mecanism patogen care poate sta la baza dezvoltării progresive a obezității și a diabetului de tip 2.

MULȚUMIRI

Mulțumim lui J. Repa (UTSW) pentru îngrijirea și manipularea animalelor, J. Shen (INS, CAS) pentru asistență cu CLAMS și X. Y. Lu (UTHSC) pentru discuții perspicace.