De la Heart and Kidney Institute, College of Pharmacy, Universitatea din Houston, Houston, Tex.

rosiglitazonă

De la Heart and Kidney Institute, College of Pharmacy, Universitatea din Houston, Houston, Tex.

De la Heart and Kidney Institute, College of Pharmacy, Universitatea din Houston, Houston, Tex.

De la Heart and Kidney Institute, College of Pharmacy, Universitatea din Houston, Houston, Tex.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

În rinichi, receptorii dopaminei prezenți pe tubii proximali joacă un rol important în reglarea excreției de sodiu și apă în diferite condiții fiziologice. 1 Receptorii dopaminei există atât pe partea apicală, cât și pe cea bazolaterală a tubului proximal. 2 Dintre receptorii dopaminei prezenți pe tubii proximali, subtipul D1 a fost implicat în natriureza și diureza mediată de dopamină. 3 La nivelul mecanismului celular de acțiune, receptorii D1, prin cuplarea cu proteinele Gs și Gq, sunt legați de adenilil ciclaza și fosfolipaza C. 4-6 Activarea receptorilor D1 și stimularea ulterioară a căilor de mesagerie secundă duc inhibarea transportorilor de sodiu - schimbător Na/H (NHE) și Na, K-ATPAază (NKA) - și, prin urmare, o creștere a excreției renale de sodiu. 4.7-9

Numeroase rapoarte au arătat că răspunsul natriuretic la dopamina infuzată exogen sau produs endogen este tocit la șobolanii spontan hipertensivi (SHR), 10,11 din cauza receptorilor D1 defecți în tubii proximali. 12 Studiile in vitro sugerează că dopamina nu reușește să inhibe NKA și NHE în tubulii proximali ai SHR. 13,14 Un studiu recent efectuat pe celule epiteliale primare ale tubului proximal derivat din rinichi hipertensivi umani a relevat hiperfosforilarea receptorului D1 cauzată de GRK4 hiperactiv ca mecanism al receptorilor D1 defecți. 15 Defectul receptorului D1 este corectat odată ce GRK4 este reglat în jos prin tratarea cu GRK4-antisens specific. 15

În mod similar, am raportat recent că dopamina nu este capabilă să inhibe activitatea NKA și NHE în tubulii proximali ai șobolanilor obezi Zucker. 16.17 Cu toate acestea, spre deosebire de observațiile făcute în SHR, numărul receptorilor D1 atât pe membrana bazolaterală (BLM), cât și pe membrana de margine a periei (BBM) au fost reduse cu 50% la obezi în comparație cu șobolanii martori slabi. 16.17

Șobolanul Zucker obez este un model de hiperinsulinemie și diabet de tip 2. 18 Sa demonstrat că insulina afectează funcția celulară a diferiților hormoni prin modificarea numărului receptorilor sau a sensibilității receptorilor la liganzii acestora. 19-21 S-a raportat că răspunsul natriuretic la dopamina exogenă a fost redus la pacienții cu diabet zaharat de tip 2. 22 Pe baza acestor studii, am emis ipoteza că reducerea numărului de receptori D1 și incapacitatea dopaminei de a inhiba transportorii de sodiu la șobolanii obezi Zucker pot fi cauzate de hiperinsulinemie cronică, care, dacă este corectată, poate duce la restabilirea numărului receptorilor D1 și a funcției sale la șobolanii obezi. Prin urmare, în prezentul studiu, am tratat șobolani obezi Zucker cu rosiglitazonă, o tiazolidinedionă, care s-a dovedit că scade insulina plasmatică, prin îmbunătățirea sensibilității la insulină. 23.24 După tratamentul cu rosiglitazonă, numărul receptorilor D1 și efectul dopaminei asupra activității NKA au fost măsurate în tubulii proximali ai șobolanilor obezi. De asemenea, s-au efectuat experimente suplimentare în celulele epiteliale primare pentru a studia efectul insulinei asupra reglării receptorului D1 în condiții experimentale mai controlate.

Metode

Tratamentul animalelor și medicamentelor

Șobolani Zucker obezi masculi în vârstă de opt până la 9 săptămâni și șobolani Zucker masculi slabi (Harlan Sprague-Dawley Inc) au fost adăpostiți în cuști de plastic și au fost hrăniți cu chow de rozătoare normal și apă de la robinet ad libitum. Șobolanii obezi au fost separați în două grupuri: șobolani martor obezi și șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă. Grupul de tratament a primit maleat de rosiglitazonă (10 mg/kg) suspendat în 1% carboxi metil celuloză în apă distilată pe cale orală timp de 4 săptămâni. Grupul martor obez a primit 1% carboxi metil celuloză. Șobolanii Lean Zucker nu au primit tratament. Fiecare grup era format din 6 șobolani.

Parametri generali și biochimici

Greutățile corporale au fost înregistrate la începutul și la sfârșitul tratamentului. La sfârșitul tratamentului, șobolanii au fost plasați în cuști metabolice timp de 24 de ore cu acces gratuit la apă. Probele de urină au fost colectate și analizate pentru sodiu și potasiu urinar folosind fotometrie cu flacără (Corning 480 Flame Photometer). Pentru măsurarea tensiunii arteriale, șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (50 mg/kg corp greutate IP). După o incizie pe linia mediană, aorta a fost cateterizată sub rinichi și tensiunea arterială a fost măsurată cu un traductor de presiune Statham și înregistrată pe un poligraf Grass timp de 30 de minute. Probele de sânge au fost colectate din aorta în tuburi acoperite cu EDTA pentru măsurarea glicemiei și a insulinei plasmatice. Glicemia a fost măsurată cu un analizor de glucoză (Roche Diagnostic Inc). Insulina plasmatică a fost măsurată prin radioimunotest, cu un kit comercial.

Izolarea și îmbogățirea tubulilor proximali

După măsurarea tensiunii arteriale și prelevarea probelor de sânge, șobolanii au fost folosiți pentru prepararea tubulilor renali proximali așa cum am descris mai devreme. 14 Proteinele au fost măsurate cu ajutorul unui kit (Pierce).

Na, testul K-ATPase

Suspensia tubulară proximală (1 mg proteină/ml) în tampon Krebs a fost incubată cu sau fără dopamină (1 nmol/L până la 1 μmol/L) la 37 ° C timp de 20 de minute. După incubare, tubulii au fost permeabilizați prin înghețarea rapidă în gheață uscată/acetonă și decongelare. Activitatea Na-K-ATPază sensibilă la Ouabain a fost măsurată 14 (exprimată ca nmol Pi/mg proteină pe minut).

Pregătirea membranei

Tubii proximali au fost omogenizați într-un tampon conținând (mmol/L) 10 Tris-HCI, 250 zaharoză, 0,2 fluorură de fenilmetilsulfonil, cocktail inhibitor de protează la pH 7,6 și centrifugat la 2500 g timp de 10 minute. Supernatantul a fost centrifugat la 24.000g timp de 20 de minute. Stratul pufos superior al peletei a fost resuspendat în același tampon, aruncat și centrifugat din nou la 24.000g timp de 20 de minute. Peleta a fost spălată cu tampon de spălare conținând 100 KCl, 100 manitol, 5 (N-[2-hidroxietil] piperazină-N′ - [[acid 2-etansulfonic]), pH 7,2 și centrifugat la 34.000g timp de 30 de minute. În cele din urmă, fracția de membrană (care conține atât BBM, cât și BLM) a fost resuspendată într-un volum mic de tampon de omogenizare și depozitată congelată pentru utilizare ulterioară.

[3 H] SCH 23390 Legare

Legarea [3 H] SCH 23390 de membranele tubulare proximale a fost efectuată în conformitate cu metoda descrisă anterior. 4.16 Pentru a genera izotermă de saturație, concentrația ligandului a fost variată de la 1 la 60 nmol/L. SCH 23390 rece (10 μmol/L) a fost utilizat pentru a determina legarea nespecifică. Datele specifice de legare au fost utilizate pentru a determina Bmax și Kvalori d.

Studii în culturi celulare primare

Cultură de celule epiteliale tubulare proximale
Western Blotting pentru proteina receptorului D1

Cantități egale de proteine ​​de membrană (8 μg) din grupurile de celule martor și tratate au fost rezolvate prin SDS-PAGE și transferate (transblotate) pe o membrană PVDF (blot). Receptorii D1 de pe blot au fost detectați utilizând un anticorp policlonal purificat de afinitate al receptorului D1 și anticorp conjugat HRP anti-iepure. Benzile au fost vizualizate cu un kit de reactivi de chemiluminescență îmbunătățit și cuantificate prin programul de proteine ​​(Kodak). Specificitatea anticorpului receptorului D1 a fost determinată mai devreme.

Statistici

Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. Rezultatele au fost supuse ANOVA unidirecțional pentru a evalua semnificația într-un grup urmat de testul multiplu Tukey post hoc pentru a evalua semnificația diferenței dintre grupuri (control slab, obez și obez tratați cu rosiglitazonă). Bmax și KValorile d din datele de legare a ligandului au fost calculate cu utilizarea software-ului Graph Prizm disponibil pe computer.

Produse chimice

Trusa de măsurare a insulinei a fost achiziționată de la Linco Research Inc. [3 H] SCH 23390 (75 Ci/mmol) a fost achiziționat de la NEN Life Sciences. Anticorpul receptorului D1 și trusa Western blot au fost achiziționate de la Alpha Diagnostic Intl. Toate celelalte substanțe chimice de cea mai mare puritate disponibile au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co sau Fisher Scientific Inc.

Rezultate

Parametri generali

După cum se arată în tabel, șobolanii obezi au fost semnificativ mai grei decât șobolanii slabi cu vârsta potrivită. Producția de urină (în 24 de ore) atât la șobolanii obezi, cât și la cei obezi tratați a fost similară, dar semnificativ mai mare decât la șobolanii slabi. Excreția urinară de sodiu pe o perioadă de 24 de ore la șobolanii obezi a fost mai mare decât la șobolanii slabi. Tratamentul cu rosiglitazonă la șobolani obezi a cauzat o excreție urinară mai mare de sodiu decât la șobolanii obezi martor. Excreția urinară de potasiu la șobolanii obezi martori și tratați a fost similară, dar mai mare decât la șobolanii slabi.

Parametrii generali și biochimici ai șobolanilor slabi, obezi și obezi tratați cu rosiglitazonă

Tensiunea arterială, glicemia și insulina plasmatică

Atât presiunea sanguină sistolică, cât și cea diastolică au fost semnificativ mai mari în controlul obez comparativ cu șobolanii slabi. Tratamentul cu rosiglitazonă la șobolani obezi a determinat reduceri semnificative ale tensiunii arteriale sistolice și diastolice (Figura 1a). Ritmul cardiac a fost similar la toate cele trei grupuri de șobolani (Figura 1b).

figura 1. Efectul tratamentului cu rosiglitazonă asupra (a) tensiunii arteriale, (b) ritmului cardiac, (c) glicemiei și (d) insulinei plasmatice. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. * În mod semnificativ diferit în comparație cu șobolanii slabi; ** semnificativ diferit în comparație cu șobolanii martori obezi. P

Glicemia în jeun a fost semnificativ mai mare la șobolanii de control obezi comparativ cu șobolanii slabi. În mod similar, insulina plasmatică la șobolanii obezi a fost de 10 ori mai mare decât la șobolanii slabi. Tratamentul cu rosiglitazonă la șobolanii obezi a scăzut glicemia la nivelul ca la șobolanii slabi. Nivelurile de insulină plasmatică la șobolani obezi după tratamentul cu rosiglitazonă au fost reduse cu ~ 50% comparativ cu șobolanii obezi martor (Figurile 1c și 1d).

Efectul dopaminei asupra activității Na, K-ATPazei în tubulii proximali

Dopamina a produs o inhibare dependentă de concentrație (1 nmol/L până la 1 μmol/L) a activității Na, K-ATPazei în tubulii proximali de la șobolanii slabi. Inhibarea activității Na, K-ATPazei de către dopamină a fost absentă la șobolanii martori obezi, dar acțiunea inhibitoare a dopaminei asupra activității enzimei a fost restabilită semnificativ la șobolanii obezi tratați cu rosiglitazonă (Figura 2). Activitatea bazală a Na, K-ATPaza (nmol Pi/mg proteină pe minut) a fost similară la 3 grupuri de șobolani (șobolani slabi, 242,3 ± 15,12; șobolani martor obezi, 209,5 ± 46,08; șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă, 290,8 ± 30,40).

Figura 2. Efectul inhibitor al dopaminei asupra activității Na, K-ATPazei în tubii proximali de la șobolani slabi, șobolani obezi și șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. * În mod semnificativ diferit în comparație cu șobolanii slabi; ** semnificativ diferit în comparație cu controlul obez și șobolanii slabi. P

[3 H] SCH 23390 Legare

[3 H] SCH 23390 legat într-o manieră saturabilă de membranele tubulare proximale de la șobolani slabi, obezi și obezi tratați cu rosiglitazonă. Analiza Scatchard a datelor a relevat o scădere semnificativă a numărului de receptori în membranele obeze de șobolan (Bmax: 382,9 ± 23,93 fmol/mg) comparativ cu șobolanii slabi (Bmax: 649,9 ± 90,96 fmol/mg). Tratamentul cu rosiglitazonă a restabilit numărul receptorilor (Bmax: 594,0 ± 36,75 fmol/mg) comparabil cu cel la șobolanii slabi. Constanta de disociere (Kd) valorile (nmol/L) au fost similare la șobolanii slabi (61,17 ± 11,30), obezi (41,05 ± 3,98) și obezi tratați (51,85 ± 2,32) la șobolani (figurile 3a până la 3c).

Figura 3. a, grafic reprezentativ Scatchard de legare specifică a [3 H] SCH 23390 la membranele tubulare proximale de șobolani slabi, șobolani obezi și șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă. b, valorile numărului maxim de site-uri de legare (Bmax) și (c) constanta de disociereKe) pentru șobolani slabi, șobolani obezi și șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. * În mod semnificativ diferit în comparație cu șobolanii slabi; ** semnificativ diferit în comparație cu șobolanii martori obezi. P

Efectul tratamentului cu glucoză și insulină asupra abundenței receptorilor D1A în celulele epiteliale primare

Folosind anticorpul receptorului D1A, am observat o singură bandă de ~ 51 kDa. Specificitatea anticorpului a fost determinată mai devreme. Analiza densitometrică a acestei benzi a arătat că expunerea PTEC primar la concentrații variabile (5, 17,5 și 25 mmol/L) de glucoză nu a afectat expresia proteinei receptorului D1. În celulele de cultură, 17,5 mmol/L este utilizat ca nivel normal de glucoză. Concentrațiile mai mari sau mai mici de glucoză nu au provocat o modificare a expresiei proteinei receptorului D1 (Figura 4a). Pe de altă parte, tratamentul cu insulină (100 nmol/L) al PTEC primar a cauzat o scădere semnificativă a expresiei proteinei receptorului D1 (Figura 4b).

Figura 4. a, Efectul concentrațiilor variate de glucoză (5, 17,5, 25, mmol/L). b, Tratament cu insulină (100 nmol/L) asupra expresiei receptorului D1 în membranele celulare epiteliale ale tubului proximal primar. Panourile superioare sunt reprezentative pentru Western blots; panourile inferioare sunt grafice cu bare cu media ± SEM a valorilor densitometrice de la 3 la 6 experimente. * Semnificativ diferit de control, Student t Test, P

Discuţie

Anterior, am raportat că efectele inhibitoare ale dopaminei asupra activităților NKA și NHE în tubulii proximali ai șobolanilor obezi hiperinsulinemici au fost semnificativ reduse în comparație cu șobolanii slabi. De asemenea, am observat că inhibarea redusă a acestor transportori a fost asociată cu o reducere semnificativă a numărului de receptori D1 în membranele tubulare proximale ale șobolanilor obezi. În studiul de față, am constatat că, dacă nivelurile plasmatice ale insulinei au fost reduse la șobolanii obezi, capacitatea dopaminei de a inhiba transportorii de sodiu din tubulii proximali a fost restabilită și numărul receptorilor de membrană D1 a fost normalizat la nivelul ca la șobolanii slabi.

În tubulii proximali, calea Gq-PLC-PKC este implicată în inhibarea mediată de receptorul D1 a NKA. 32 Restaurarea completă a numărului receptorului D1, dar capacitatea parțială a dopaminei de a inhiba NKA sugerează că calea Gq-PLC-PKC poate să nu fie complet restabilită. Se poate specula că scăderea suplimentară a nivelurilor de insulină plasmatică la șobolani obezi ar fi necesară pentru a restabili deficiența rămasă în funcția receptorului D1, deoarece se referă la calea Gq-PLC-PKC.

Numeroase studii au arătat că tensiunea arterială crescută se dezvoltă la șobolanii obezi Zucker. 4,33,34 În plus, sa raportat că răspunsul natriuretic la expansiunea volumului la șobolanii obezi este atenuat în comparație cu șobolanii slabi, 35 sugerând mecanisme afectate responsabile de natriureză, inclusiv sistemul dopaminergic. În studiul de față, am constatat că tratarea șobolanilor obezi Zucker cu rosiglitazonă a determinat o creștere a excreției urinare de sodiu și o reducere a tensiunii arteriale comparativ cu șobolanii obezi martor. Numeroase mecanisme pot fi responsabile pentru creșterea excreției urinare de sodiu și reducerea tensiunii arteriale. De exemplu, deoarece insulina este antinatriuretică, 36,37 o scădere în sine a nivelurilor de insulină plasmatică va duce la o creștere a excreției de sodiu. A fost raportată o creștere a activității angiotensinei II, un alt hormon antinatriuretic, în tubulii proximali ai obezilor, comparativ cu șobolanii slabi. 29,38 Este probabil ca reducerea nivelului de insulină plasmatică să fi redus și activitatea angiotensinei II și, prin urmare, creșterea excreției tubulare de sodiu. Studiile in vitro au arătat că insulina reglează în sus receptorii AT1. De asemenea, este probabil ca o scădere a insulinei plasmatice să fi restabilit efectul natriuretic bazal al dopaminei endogene.

Perspectivă

Descoperirile noastre care demonstrează că tratamentul șobolanilor obezi Zucker cu sensibilizant la insulină rosiglitazonă restabilește funcția receptorului dopaminei și scade tensiunea arterială, au o relevanță clinică importantă. Tiazolidenionele, cum ar fi rosiglitazona, sunt utilizate în tratamentul diabetului de tip 2 și s-au dovedit a fi eficiente la unii pacienți în controlul bolii. Am arătat că tratamentul cu rosiglitazonă, în timp ce scade insulina plasmatică și glicemia, este, de asemenea, eficient în restabilirea capacității de reacție renală la dopamină. În măsura în care dopamina endogenă joacă un rol important în menținerea homeostaziei de sodiu în timpul creșterii aportului de sodiu, este probabil ca pacienții tratați cu rosiglitazonă să poată realiza homeostazia de sodiu prin mecanismul dopaminergic. Aceștia vor putea, de asemenea, să prezinte o reacție renală la dopamina exogenă. Prin urmare, acestea sunt beneficiile adăugate pe care terapia cu rosiglitazonă le va oferi pacienților diabetici.

Acest studiu a fost susținut parțial de grantul Institutelor Naționale de Sănătate DK-58743 de la Institutul Național pentru Diabet, Digestiv și Boli Renale.