Editat de Solomon H. Snyder, Facultatea de Medicină a Universității Johns Hopkins, Baltimore, MD și aprobat la 17 mai 2011 (primit pentru revizuire 4 martie 2011)

sistem

Abstract

Oxidul nitric (NO) exercită răspunsuri celulare pleiotrope asupra proliferării, apoptozei, neurotransmisiei și neurotoxicității în mai multe tipuri de celule prin intermediul proteinei S-nitrozilare. Această modificare are loc prin intermediul reacției oxidative între NO și cisteină (Cys) tiol în prezența unui acceptor de electroni (cum ar fi O2 sau un metal de tranziție) sau prin transnitrozilare de la S-nitrozotiol la un alt Cys tiol (1-3) . Au fost publicate mai multe metode de detectare a proteinelor S-nitrozilate (SNO-Ps) prin utilizarea anticorpilor, fotolizei și afinității cu mercurul (4). În special, testul biotin-switch este un imunoblot modificat dezvoltat de Jaffrey și Snyder care a fost utilizat în mod obișnuit pentru a detecta SNO-Ps endogen; această metodă a avansat mult domeniul (5). Ulterior, au fost dezvoltate alte metode pentru a detecta SNO-Ps (6), dar unele dintre ele implică probe tratate cu concentrații mari de donator de NO. Cu toate acestea, în prezența concentrațiilor ridicate de NO, este posibil ca unele reziduuri de Cys să fie nitrosilate artificial S.

Matricile de anticorpi au fost utilizate pentru profilarea nivelurilor de expresie a proteinelor cu sensibilitate ridicată. Fiecare anticorp detectat poate fi validat pentru capacitatea sa de a lega proteinele în test. Probele care se hibridizează cu fiecare anticorp din matrice pot fi ușor detectate. Deși un număr de proteine ​​au fost identificate ca substraturi pentru S-nitrozilare în ultimii ani (3-6), am emis ipoteza că mulți mai mulți candidați modificați de niveluri fiziologice de NO ar putea rămâne încă de identificat. Prin urmare, am testat dacă o matrice de anticorpi ar putea fi adaptată pentru identificarea SNO-Ps suplimentare și a funcțiilor lor fiziologice (patologice).

În studiul de față, am încercat să izolăm SNO-Ps în stare fiziologică printr-o matrice de anticorpi. Am pregătit extracte din celule tratate sau netratate cu NO și etichetate în mod specific cu biotină. Am descoperit că fosfataza cu omologie de secvență la tensină (PTEN) este preferențial S-nitrosilată prin concentrații scăzute de NO. Deși alte rapoarte au arătat că PTEN poate suferi nitrosilare S prin concentrații ridicate de NO (7-13), aici am găsit o semnificație a funcției (patologice) fiziologice a PTEN S-nitrosilat (SNO-PTEN) pe calea Akt folosind sisteme in vivo și in vitro. Rezultatele noastre sugerează că inhibarea activității PTEN prin S-nitrozilare mărește semnalizarea Akt, contribuind astfel la supraviețuirea celulei în creierele ischemice și la activarea NO sintetazei endoteliale (eNOS).

Rezultate

Screening pentru proteine ​​neuronale S-nitrosilate.

Inițial, am dezvoltat un sistem unic de screening pentru izolarea SNO-Ps nedescrisă anterior în sistemele neuronale folosind o matrice de anticorpi. Probele au fost preparate din celule SH-SY5Y ale neuroblastomului uman care fuseseră expuse la ionoforul de calciu A23187, care activează NO sintază neuronală endogenă (nNOS) și eNOS pentru a produce concentrații fiziologice de NO. Reziduurile Cys nitrosilate S din lizatele celulare au fost convertite în forma lor biotinilată utilizând tehnica de comutare a biotinei (5). Aceste probe, conținând cisteine ​​biotinilate, au fost supuse unei serii de anticorpi și s-au detectat intensități fluorescente (Fig. S1). Au fost identificați douăzeci și cinci de candidați, inclusiv SNO-Ps cunoscuți, cum ar fi caspaza, NOS și HDAC (Tabelul S1; ref. 14-16). Dintre ceilalți candidați, ne-am concentrat asupra efectului S-nitrozilării asupra activității PTEN și a funcțiilor sale fiziologice. PTEN este un regulator inhibitor al căii de semnalizare PI3-kinază/Akt, atenuând astfel creșterea, migrația și supraviețuirea celulei (17-21).

S-Nitrosilarea PTEN.

Pentru a valida S-nitrosilarea PTEN, am examinat dacă PTEN a fost semnificativ S-nitrosilat printr-o concentrație scăzută de donator fiziologic de NO S-nitrosocisteină (SNOC). SNOC a îmbunătățit semnificativ nivelul de SNO-PTEN în lizatele celulare și celulele intacte. SNO-PTEN nu a fost detectat în testele de control biotin-switch efectuate fără ascorbat pentru a elimina NO, prevenind astfel înlocuirea NO cu biotină (Fig. 1A). După cum era de așteptat, PTEN a fost extrem de sensibil la NO; Formarea SNO-PTEN a fost detectată în celulele 293 ale rinichiului embrionar uman (HEK) după tratamentul cu SNOC 1-10 μM (Fig. 1 B și C). Mai mult, această modificare a fost găsită și în celulele expuse la diferite alte tipuri de donatori de NO, inclusiv S-nitrozo-glutation (GSNO) și 2- (N, N-dietilamino) -diazenolat-2-oxid (DETA-NONOate; S2).

Apoi, pentru a investiga dacă NO generat endogen induce, de asemenea, formarea SNO-PTEN, am folosit celule HEK care exprimă stabil nNOS. PTEN a fost S-nitrosilat de NO endogen ca răspuns la A23187 într-o manieră sensibilă la inhibitorii NOS (Fig. 1D și Fig. S3). Mamifere PTEN are cinci cisteine ​​în domeniul său fosfatază (17). Pentru a determina locul țintă al S-nitrozilării pe PTEN, am mutat fiecare cisteină în serină și am testat formarea SNO-PTEN utilizând metoda de schimbare a biotinei. Celulele HEK au fost transfectate cu vectori de expresie care codifică fie FLAG-PTEN de tip sălbatic (WT), fie forme mutante ale proteinei. După 24 de ore, celulele au fost expuse la SNOC sau condiții de control și au fost monitorizate pentru SNO-PTEN. Am constatat că mutantul C83S PTEN nu a produs aproape niciun semnal, sugerând că Cys-83 a fost locul predominant de S-nitrozilare (Fig. 1E). Mai mult, am efectuat un test chimic pe PTEN recombinant purificat pentru a detecta S-nitrozilarea folosind 2,3-diaminonaphtalene (DAN). DAN se convertește stoichiometric în 2,3-naftiltriazol fluorescent în prezența NO eliberat din S-nitrozotiol. PTEN tratat cu SNOC a dus la formarea semnificativă de SNO-P, în timp ce mutantul PTEN (C83S) a fost complet lipsit de semnal fluorescent (Fig. S3).

Se știe că PTEN este oxidat de concentrații mari de H2O2 (> 0,5 mM), ceea ce duce la formarea de legături disulfidice între Cys-71 și situl activ Cys-124 (22). Astfel, am testat dacă NO a indus și formarea de legături disulfurice în PTEN. Cu toate acestea, chiar și concentrații mari de NO nu au dus la formarea disulfurii (Fig. 1F), în concordanță cu noțiunea că S-nitrozilarea PTEN a avut loc numai la Cys-83. Astfel, reziduurile disparate de Cys par a fi implicate în S-nitrozilare și oxidarea H2O2 a PTEN.

SNO-PTEN inhibă activitatea fosfatazei prin C83.

Pentru a determina dacă S-nitrozilarea a afectat activitatea PTEN, am monitorizat inițial activitatea enzimei PTEN recombinante. Activitatea fosfatazei a fost evaluată cu un test standard prin măsurarea fosfatului eliberat din fosfatidilinozitol-3,4,5-trisfosfat [PI (3,4,5) P3], un substrat fiziologic (23). Expunerea PTEN recombinant la SNOC a scăzut semnificativ nivelul fosfatului într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2A). Această scădere a fost inversată la niveluri bazale după incubare cu agentul de reducere a substanțelor chimice DTT, indicând faptul că nitrosilarea S în PTEN a fost reversibilă (Fig. 2B). Apoi, am evaluat activitatea enzimatică a mutanților recombinanti PTEN și Cys. Cys-124 este esențial pentru activitatea PTEN; astfel, chiar și în absența expunerii SNOC, mutantul C124S și-a pierdut complet activitatea enzimatică (Fig. 2C). În schimb, mutantul C83S și-a menținut activitatea enzimatică chiar și după expunerea la concentrații mari de SNOC (Fig. 2C). Prin urmare, am făcut observația că nu numai că Cys-83 este principalul site țintă pentru oxidarea PTEN prin S-nitrozilare, dar că această modificare influențează activitatea enzimatică printr-un mecanism distinct de cel al oxidării prin H2O2.

S-nitrozilarea PTEN reglează activitatea fosfatazei sale. (A și B) Efectul S-nitrozilării asupra activității fosfatazei PTEN. (A) PTEN-ul condensat cu GST exprimat in vitro a fost incubat cu concentrațiile indicate de SNOC și evaluat prin testarea fosfatazei. (B) PTEN recombinant și SNO-PTEN au fost testați pentru activitatea fosfatazei lipidice împotriva PI (3,4,5) P3 cu sau fără DTT. Eliberarea fosfatului a fost detectată colorimetric cu reactiv verde Biomol. Valorile sunt medii ± SEM, n = 5; * P 50 μM SNOC (Fig. 1B). Astfel, în aceste condiții, creșterea nivelurilor de pAkt a apărut numai după expunerea la concentrații scăzute (10 μM) de SNOC și nu după concentrații ridicate (250 μM). Am monitorizat apoi activitatea Akt în celule ca răspuns la diferite concentrații de SNOC. Concentrațiile scăzute de SNOC (≤10 μM) au crescut, în timp ce concentrațiile ridicate (≥250 μM) au atenuat, fosforilarea substratului de către Akt (peNOS la Ser-1177; Fig. 3 C și D).

Formarea rezultatelor SNO-PTEN în fosforilarea substraturilor Akt.

Apoi am întrebat dacă activarea Akt după expunerea celulelor la concentrații scăzute de SNOC a dus la fosforilarea substraturilor Akt. Activitatea Akt a fost evaluată prin măsurarea nivelului mTOR fosforilat (pmTOR; la Ser-2448) și a substratului Akt (27). Nivelurile pmTOR au fost semnificativ crescute după expunerea la 10 μM SNOC, după o perioadă de timp care a paralel cu fosforilarea Akt (Fig. 3 G și H). Aceste observații funcționale au fost, de asemenea, în concordanță cu noțiunea că concentrațiile scăzute de NO (≤10 μM) au indus formarea SNO-PTEN, dar nu și SNO-Akt și, prin urmare, au activat cascada de semnalizare Akt. Pentru a demonstra în continuare concluzia noastră că activarea Akt după expunerea la concentrații scăzute de NO este dependentă de S-nitrozilare și de inhibarea rezultată a PTEN, am investigat efectul wortmannin, un inhibitor al PI3-kinazei, asupra activării Akt indusă de NO. Tratamentul cu wortmannin a dus la atenuarea semnificativă a formării pAkt ca răspuns la o concentrație scăzută de SNOC (Fig. 3I). Această observație este în concordanță cu noțiunea că NO stimulează semnalizarea Akt prin formarea SNO-PTEN cu inhibarea rezultată a activității PTEN, deoarece această creștere a pAkt ar avea loc prin creșterea activității PI3-kinazei.

În plus, s-a demonstrat că eNOS este activat prin fosforilarea dependentă de Akt (28, 29). Prin urmare, am întrebat dacă activarea Akt după formarea SNO-PTEN a dus la fosforilarea/activarea eNOS în celulele endoteliale. Am constatat că nivelul proteinei eNOS fosforilate (peNOS) a crescut rapid și a fost susținut până la 2 ore după expunerea la 10 μM SNOC în linia de celule endoteliale F2 de șoarece (Fig. 4 A și B). Această fosforilare eNOS indusă de SNOC (la Ser-1177) a fost abrogată de inhibitori Akt (Fig. 4C; ref. 30 și 31). Apoi, am monitorizat activitatea eNOS prin măsurarea conversiei [3 H] argininei în [3 H] citrulină (32). Am constatat că SNOC a crescut semnificativ formarea citrullinei din arginină într-un mod sensibil la inhibitorii Akt (Fig. 4D). Aceste constatări sunt în concordanță cu noțiunea că activitatea Akt îmbunătățită, rezultată din nitrozilarea PTEN, duce la fosforilarea și activarea eNOS.

S-nitrozilarea PTEN promovează neuroprotecția prin activarea Akt in vitro și in vivo. (A) S-nitrozilarea PTEN și Akt după ischemie cerebrală la șoareci. Țesutul cerebral din emisferele infarctate a fost recoltat 24 ore după un MCAO de 2 ore și supus testului biotin-switch pentru a detecta in vivo S-nitrozilarea PTEN și Akt. (B) Raportul dintre SNO-P crescut și proteina totală. Bloturile din testele biotin-switch și analizele Western au fost cuantificate prin densitometrie și s-a calculat raportul relativ SNO-PTEN la PTEN total sau SNO-Akt la Akt total în ambele emisfere. Valorile sunt medii ± SEM, n = 4; * P 1 N.N., K.T. și T. Nishiya au contribuit în mod egal la această lucrare.

Contribuțiile autorului: T.U. cercetare proiectată; N.N., K.T., T. Nishiya, H.T., K.O., W.H., M.A., H.M., K.A., H.K., T. Nakamura și T.U. cercetări efectuate; N.N., K.T., T. Nishiya, K.A., H.H., M.M., S.A.L. și T.U. date analizate; și S.A.L. și T.U. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.