Chirurgia de by-pass gastric Roux-en-Y pentru obezitate are efecte rapide, nedependente de greutate, asupra metabolismului glucozei, care nu pot fi explicate doar prin înfometarea perioperatorie.

celulelor

Care sunt noile descoperiri?

Ketogeneza intestinală, indusă de hrănirea prelungită cu conținut ridicat de grăsimi, poate fi un mecanism de reacție bontă la GLP-1 la subiecții obezi înainte de operație. După o intervenție chirurgicală de bypass gastric, acest mecanism poate fi ameliorat prin inhibarea ketogenezei intestinale, promovând îmbunătățirea rapidă a răspunsului GLP-1 după operație.

Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul previzibil?

Poate fi posibil să se țintească farmaceutic ketogeneza intestinală și astfel să se contracareze efectul diabetogen al obezității fără a fi nevoie de o intervenție chirurgicală de bypass gastric.

INTRODUCERE

By-passul gastric Roux-en-Y (RYGB) este eficient în tratamentul pe termen lung al obezității morbide și al diabetului de tip 2.1 Pierderea în greutate în sine este un factor important în spatele îmbunătățirii stării metabolice, dar RYGB activează, de asemenea, post-operatoria timpurie independentă de greutate mecanisme, de exemplu, eliberarea indusă de masă a peptidelor intestinale.2 3 Astfel de efecte asociate RYGB au evidențiat efectele reconfigurării anatomice a tractului alimentar în metabolismul întregului corp. Prin urmare, am folosit RYGB ca model pentru a încerca să găsim noi mecanisme intestinale asociate în intestinul subțire proximal pentru îmbunătățirea metabolismului glucozei.

Materiale și metode

Chirurgie și pacienți

Material suplimentar

Caracteristicile pacientului în proteomică, confirmare și grupuri de dietă

Analiza globală a expresiei proteinelor a mucoasei jejunale umane

Tehnica a fost descrisă mai devreme.11 Doar proteinele fiind modificate în mod constant la toți pacienții și cu o schimbare de cel puțin 50% față de valoarea inițială au fost incluse pentru o analiză ulterioară.

Studii pe animale

Șoareci masculi C57BL/6J de patru săptămâni până la 5 săptămâni au fost cumpărați de la Harlan (Horst, Olanda). Animalele au fost menținute sub temperatură controlată (23 ° C) și lumină (luminile aprinse, 06: 30–18: 30 ore), cu acces ad libitum la apă și alimente peletate (R34 Lactamin, Kimstad, Suedia) cu un conținut de nutrienți de g %: grăsimi 4%, proteine ​​16,5%, carbohidrați 58,0%; conținut caloric total: 3 kcal/g. Începând cu vârsta de 6 până la 8 săptămâni șoarecii au fost hrăniți cu HFD sau cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD) timp de 3 săptămâni sau 3 luni. HFD consta din alimente peletate (Surwit Diabetogenic Rodents Diet, D12309; Research Diets, New Brunswick, New Jersey, SUA) și avea un conținut de nutrienți în g%: grăsimi 35,9%, proteine ​​23%, carbohidrați 35,5%; conținut caloric total: 5,6 kcal/g. Animalele LFD au continuat să primească dieta obișnuită (R34).

În primul set de experimente șoarecii au fost sacrificați după 3 săptămâni de LFD sau HFD și diferite părți ale intestinului subțire; au fost prelevate duoden (proximal 3 cm), jejun (mijloc 3 cm) și ileon (distal 3 cm), precum și ficatul. Probele cu grosime completă de perete intestinal și un lob hepatic au fost înghețate rapid în azot lichid și menținute congelate (-70 ° C) pentru analiza ulterioară a expresiei proteinelor prin Western blot (vezi mai jos).

Într-un al doilea set de experimente șoarecii au fost hrăniți cu LFD sau HFD timp de 3 luni. În ziua studiului, alimentele au fost îndepărtate timp de 45 de minute înainte de experimentare pentru a sincroniza starea de hrănire. La începutul experimentului a fost administrat un gavaj oral cu 250 ofL de Intralipid (ulei de soia 200 mg/ml, fosfolipide de ou purificate, glicerol, hidroxid de sodiu, apă; Fresenius Kabi, Suedia), conținând oricare dintre vehicule (20 µL de acetat de etil ), 2,5 mg de inhibitor al 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintazei mitocondriale (mHMGCS) himeglusină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, SUA; dizolvat în vehicul) sau 25 mg de β-hidroxibutirat (βHB, Sigma- Aldrich, St Louis, MO; dizolvat în vehicul). La 15, 30 sau 120 min, probele de sânge venos au fost preluate din coadă și βHB a fost analizată folosind un senzor GlucoMen LX β-cetonă (A. Menarini Diagnostics, Firenze, IT).

Într-un al treilea set de experimente șoarecii au fost ținuți pe LFD sau HFD timp de 3 săptămâni și au postit timp de 6 ore înainte de începerea experimentului. Apoi a fost administrat un gavaj oral cu 500 ofL de Intralipid (Fresenius Kabi) și după încă 90 de minute șoarecii au fost anesteziați folosind izofluran. A fost efectuată o laparotomie, iar vena portă a fost identificată și perforată cu ajutorul unui ac subțire și s-a colectat sânge. Probele de sânge periferic au fost extrase concomitent din ochi. Probele de sânge au fost centrifugate pentru a prepara serul. βHB a fost analizat în ser folosind un kit EnzyChrom Ketone Body Assay (BioAssay Systems, Hayward, California, SUA).

Omogenizarea biopsiei, Western blot și cuantificarea βHB

Pentru toate cohortele umane și toate specimenele de mucoasă jejunală congelată murină, probele de țesut au fost preparate așa cum s-a descris mai sus.11 Pentru fiecare bandă detectată, densitatea a fost cuantificată și exprimată ca procent din densitățile totale ale tuturor benzilor de acea dimensiune specifică pe aceeași membrană. Gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca control al încărcării. Pentru anticorpi, a se vedea tabelul suplimentar 1 online.

Material suplimentar

Pentru cuantificarea βHB, omogenizările tisulare peri-RYGB și post-RYGB din „cohorta dietei” au fost analizate folosind kitul de testare colorimetrică βHB (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, SUA) și rezultatele normalizate pentru a omogeniza conținutul de proteine.

Histologia mucoasei jejunale umane

Specimenele de mucoasă jejunală preluate de la pacienții peri-RYGB și post-RYGB (n = 5, selecție aleatorie din cohorta de confirmare) au fost prelucrate în conformitate cu procedurile standard pentru prepararea probei de histologie. Pe scurt, biopsiile au fost fixate în formaldehidă 4% tamponată cu fosfat, deshidratate și încorporate în parafină. Biopsiile încorporate au fost tăiate în 5 secțiuni m secțiuni. Pentru imunofluorescență, secțiunile au fost rehidratate, antigenele au fost recuperate și secțiunile au fost blocate în ser normal de capră 5% (31872, ThermoFisher Scientific, Rockford, Illinois, SUA) înainte de incubare cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C. Lamele au fost apoi spălate și incubate cu anticorpul secundar timp de 2 ore la temperatura camerei și contracolorate cu colorare Hoechst (H6024, Sigma-Aldrich). Pentru anticorpi vezi tabelul suplimentar online 1. Secțiunile cu tampon de blocare în locul anticorpului primar au fost incluse ca martori negativi. Pentru histologie generală, colorarea H&E a fost efectuată conform procedurilor standard.

Cultură primară jejunală de șoarece și cuantificare a secreției GLP-1

Implicarea pacientului și a publicului

Publicul și pacienții nu au fost implicați în proiectarea, recrutarea sau desfășurarea acestui studiu.

Analize statistice

Testul t al studentului a fost utilizat pentru a analiza modificările statistice ale nivelurilor de proteine ​​în analiza proteomică a intensităților spotului pe electroforeză bidimensională pe gel. Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de testul diferenței semnificative sincer (HSD) a lui Tukey a fost utilizată pentru a analiza datele de secreție GLP-1. Testul non-parametric Wilcoxon semnat-rang a fost utilizat pentru date umane asociate și testul non-parametric Mann-Whitney U pentru date de șoareci nepereche. Toate statisticile au fost realizate folosind Prism 7 și 8 (GraphPad, La Jolla, California, SUA). Dacă nu se specifică altfel, media și SEM sunt prezentate în cifre.

Rezultate

RYGB a redus expresia proteinei jeunale mHMGCS

Confirmarea reducerii asociate intervenției chirurgicale a nivelurilor corpului mHMGCS și a cetonei mucoase

Ilustrație schematică a mecanismului corpului cetonic propus pe celule enteroendocrine producătoare de GLP-1 (CEE). Expunerea la acizi grași liberi cronici (FFA) induce creșterea expresiei mHMGCS și producția de βHB în celulele epiteliale jejunale din vârfurile vilozităților. βHB ajunge la CEE prin microcirculația venoasă a vilozităților și acționează prin FFAR3/GPR41 pentru a inhiba producerea/eliberarea GLP-1. Operația RYGB poate interfera cu acest mecanism prin scăderea disponibilității FFA și a expresiei mHMGCS. GAPDH, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază; GLP-1, peptidă-1 asemănătoare glucagonului; mHMGCS, 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintază mitocondrială; RYGB, bypass gastric Roux-en-Y.

Discuţie

Foarte puține rapoarte sunt disponibile cu privire la expresia enzimei ketogene limitate a ratei mHMGCS în mucoasa intestinală subțire umană.16 Arătăm că intervenția chirurgicală RYGB în sine și nu scăderea aportului caloric, a dus la o scădere substanțială a expresiei mHMGCS și a corpului cetonic jejunal ( nivelurile βHB). Ar putea exista mai multe motive pentru scăderea expresiei și a producției de cetonă după intervenția chirurgicală. De exemplu, scăderea lipolizei datorată devierii lipazelor biliare și pancreatice de la nivelul membrului alimentar ar putea provoca indisponibilitatea substratului. Un alt motiv ar putea fi utilizarea crescută a lipidelor în scopuri anabolice sau oxidarea lipidelor pentru cererea de energie, ca urmare a hipertrofiei care apare la nivelul membrului alimentar al jejunului după RYGB.5 17 18

Se știe că corpurile cetonice sunt produse de ficat în timpul foametei sau dietă ketogenică cu conținut scăzut de grăsimi cu conținut scăzut de carbohidrați pentru a furniza energie pentru țesuturile periferice, inclusiv creierul, atunci când nivelurile de glucoză sunt scăzute. Ketogeneza are o asociere cu acizi grași scurți, cum ar fi butiratul, care induc atât expresia mHMGCS prin PPARα, cât și acționează ca substraturi precursoare prin β-oxidare.16 În intestinul subțire, mHMGCS are o expresie legată de aportul alimentar. S-a demonstrat anterior că este extrem de exprimat în perioada postnatală timpurie la rozătoarele care alăptează, iar foamea i-a scăzut expresia, în opoziție cu ketogeneza hepatică. 19 După înțărcare la LFD, expresia a dispărut din intestin.20 Este probabil grăsimea bogată -conținutul laptelui matern care induce mHMGCS. Expresia intestinului subțire al mHMGCS poate fi, de asemenea, reactivată prin dieta bogată în grăsimi la rozătoarele adulte.21 22 Astfel, ketogeneza intestinală ar putea reprezenta un mecanism senzorial al grăsimii mucoasei intestinului subțire. Se pare că acesta este un semnal complet diferit, mediat de nutrienți, comparativ cu ketogeneza sistemică, în cursul căreia s-a sugerat că cetonele acționează ca metaboliți de semnalizare sistemică care pot proteja împotriva rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2.

În experimentele pe animale, am confirmat că expresia mHMGCS a fost substanțial crescută în jejun după hrănirea cu HFD. Această expresie conduce la creșterea nivelului de cetonă βHB în sângele portal al șoarecilor. Mai mult decât atât, producția de βHB a fost complet blocată prin pretratare per-orală cu inhibitorul specific al mHMGCS hymeglusin. Nivelurile locale ale corpurilor cetonice la locul de producție, adică celulele epiteliale ale mucoasei și în microcirculația vilozităților, pot fi totuși substanțial mai mari (aproximativ prin măsurătorile noastre mucoasei ∼10 mM), deoarece sângele portal este „diluat” de venos întoarcerea din alte regiuni ale intestinului decât jejunul. O limitare potențială a studiului nostru este că nu a fost posibil să se obțină probe postprandiale pentru măsurarea corpului cetonic la pacienții operați cu RYGB. Recent s-a arătat că absorbția și oxidarea postprandială a acidului gras a crescut (și nu a scăzut) la șobolanii operați cu RYGB.

Încetarea corpurilor inhibitoare de cetonă pe CEE ar putea contribui la o reacție crescută a peptidelor intestinale după intervenția chirurgicală RYGB. În cultura celulară pe CEE primare, corpul cetonic βHB a inhibat eliberarea GLP-1 stimulată de glucoză cu -40% comparativ cu valoarea inițială. Această inhibiție a fost mediată de un receptor cuplat Gαi, deoarece a fost complet inversat de receptorul-inhibitor cuplat Gαi PTX. Receptorul cetonic cuplat Gαi/acidul gras FFAR3/GPR41 este exprimat în epiteliul intestinal subțire, unde este foarte îmbogățit în CEE.14 15 Sa demonstrat anterior că este implicat în reglarea homeostaziei energetice, prin intermediul, de exemplu, PYY și GLP-1.24 Datele noastre sugerează un nou mecanism, deoarece receptorul-inhibitor cuplat Gαi PTX a blocat efectul supresiv atât al βHB, cât și al somatostatinei asupra eliberării GLP-1 din CEE. Cu toate acestea, nu am putut concluziona definitiv dacă inhibarea indusă de βHB a secreției GLP-1 este mediată de FFAR3 sau de un receptor alternativ cuplat Gαi, cum ar fi GPR109a, în CEE. GPR109a este totuși exprimat la un nivel mult mai scăzut în CEE.15

Pe scurt, sugerăm o reconstrucție fiziologică chirurgicală a membrului alimentar prin inducerea deficitului de substrat pentru ketogeneza. Acest lucru ar putea contribui la explicația îmbunătățirii foarte rapide a secreției de hormon incretin observată după RYGB, așa cum am arătat recent, este evidentă deja la 2 zile după operație.3 Aceste constatări sunt în concordanță cu „antiincretina” și „excluderea din față” propuse. ipoteze care ar putea explica efectele intervenției chirurgicale RYGB asupra sațietății îmbunătățite și a homeostaziei glucozei.10 Aceasta poate deschide o nouă cale de dezvoltare a medicamentelor anti-obezitate și anti-diabetice, vizând producerea mHMGCS și a cetonei mucoasei intestinale, pentru a crește CEE capacitatea de reacție și eliberarea peptidei intestinale la stimularea nutrienților.

Mulțumiri

Autorii ar dori să mulțumească profesorului Claes Ohlsson și Kristina Wallenius pentru lectura critică a manuscrisului. Analiza proteomicii a fost efectuată la Facilitatea Proteomică Core, Academia Sahlgrenska, Universitatea din Gothenburg. Experimentele pe animale din Göteborg au fost efectuate în colaborare cu și la Centrul de fiziologie și bio-imagistică (CPI), Academia Sahlgrenska, Universitatea din Göteborg. Imunotestele tGLP1 au fost efectuate la laboratorul de teste biochimice de bază ale spitalului Addenbrooke.