Abstract

Expunerea cronică la niveluri ridicate de glucocorticoizi (sindromul Cushing) cauzează obezitate viscerală și anomalii metabolice asociate ale rezistenței la insulină, diabet de tip 2, dislipidemie și hipertensiune. Anomalii metabolice similare apar în obezitatea idiopatică umană și în sindromul metabolic; cu toate acestea, acest lucru apare de obicei fără exces de cortizol plasmatic (1,2).

țesut

În schimb, șoarecii cu o perturbare țintită a genei 11β-HSD-1 (șoareci 11β-HSD-1 -/-) prezintă o toleranță crescută la glucoză, răspunsuri gluconeogene atenuate (15) și un profil îmbunătățit de lipide și lipoproteine ​​(16). Aceste efecte au fost atribuite anterior unor funcții metabolice induse de glucocorticoizi în ficat, în ciuda nivelurilor plasmatice modest crescute de corticosteron la șoarecii 11β-HSD-1 -/- (15,16), sugerând că activitatea 11β-HSD-1 este într-adevăr un amplificator crucial al acțiunii glucocorticoide intracelulare în ficat in vivo. Inhibarea farmacologică a 11β-HSD-1 in vivo îmbunătățește, de asemenea, glicemia și crește sensibilitatea la insulină hepatică (17-20). Cu toate acestea, astfel de studii au utilizat medicamente nespecifice, cum ar fi carbenoxolonă, care nu realizează inhibarea adipoză a 11β-HSD-1 (19) sau studii specifice ale inhibitorilor 11β-HSD-1 (20) care s-au adresat doar funcției hepatice. Prin urmare, contribuția potențială pe care o face inhibarea țesutului adipos 11β-HSD-1 la un fenotip metabolic îmbunătățit in vivo rămâne necunoscută. Pentru a aborda această problemă, am examinat distribuția și funcția adipoză la șoarecii nulizigoti 11β-HSD-1 atât pe fundalul original al tulpinii intrinsec rezistente la obezitate (MF-1), cât și pe cei nou încrucișați pe C57BL/6J susceptibil la obezitate/diabet încordare.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Toate studiile au fost efectuate în Marea Britanie. Linii directoare ale biroului intern pentru proceduri științifice la animalele de laborator. Șoarecii masculi MF1-11β-HSD-1 -/- și controalele lor de tip sălbatic, potrivite în funcție de vârstă, crescute așa cum s-a descris anterior (15), au fost adăpostite în condiții standard pe un ciclu de lumină: întuneric de 12/12 ore la 7: 00 PM). Transgenul țintit 11β-HSD-1 a fost rederivat pe tulpina C57BL/6J prin transfer embrionar și apoi încrucișat cu șoareci C57BL/6J timp de 10 generații înainte de studiile actuale. Șoarecilor adulți, cu vârsta potrivită, masculin, de tip sălbatic și 11β-HSD-1 -/- (n = 6-10) li s-a administrat un control (11% calorii sub formă de grăsime, Research Diets D12328; Research Diets, New Brunswick, NJ ) sau dietă bogată în grăsimi (58% calorii sub formă de grăsimi, Research Diets D12331) timp de 18 săptămâni, o dietă optimizată anterior pentru creșterea în greutate și rezistența la insulină (21). A fost utilizată și o dietă alternativă diabetogenă (22) care produce colesterol LDL crescut (greutate/greutate: proteine ​​20%, carbohidrați 36,4%, grăsimi [untură] 36,4%). Șoarecii au fost adăpostiți individual pentru ultima săptămână a experimentului. Șoarecii au fost uciși în jurul orei 8:00, în decurs de 1 minut de la deranjarea fiecărei cuști.

Test intraperitoneal de toleranță la glucoză/insulină.

După 18 săptămâni pe o dietă martoră sau bogată în grăsimi, șoarecii transgenici și de tip sălbatic au fost postiti peste noapte și apoi injectați intraperitoneal cu 2 mg/gd-glucoză (soluție stoc 25% în soluție salină) sau 1 unitate/kg corp greutate Humulin S ( Lilly, Basingstoke, Hampshire, Marea Britanie). Probele de sânge au fost prelevate prin venezecție a cozii în EDTA-micro tuburi (Sarstedt, Leicester, Marea Britanie) la 0 min (înainte de injectare și în decurs de 1 min de la deranjarea cuștii) și la intervale de 15, 30, 60 și 120 de minute după încărcarea de glucoză sau bolusul de insulină. Glucoza a fost măsurată cu testul Sigma HK (Sigma, Poole, Marea Britanie). Pentru testele de toleranță la insulină, animalele au fost postite timp de 6 ore.

Parametrii plasmatici și serici.

Lipidele serice au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (16). Distribuția colesterolului și a trigliceridelor între lipoproteine ​​a fost determinată prin fracționarea cromatografiei lichide cu proteine ​​rapide (16). Leptina a fost măsurată prin test imunosorbent legat de enzime (Crystalchem, Downers Grove, IL). Acizii grași liberi au fost măsurați cu un set de acizi grași neesterificați Waco (Alpha Laboratories, Hampshire, Marea Britanie). Corticosteronul a fost măsurat în plasmă cu o radioimunologie internă (15). Nivelurile de corticosteron intra-adipos au fost determinate prin radioimunotest (ICN Diagnostics, Orangeburg, NY) așa cum este descris (7).

Extracția și analiza ARN.

Țesuturile au fost înghețate rapid în azot lichid și omogenizate în Trizol (Life Technologies, Paisley, Marea Britanie). ARN-ul total a fost șters în conformitate cu procedura standard de Northern blot și expresia genică analizată așa cum este descris (16). Exemplele de secvențe au fost după cum urmează: proteina de decuplare (UCP) -2, (înainte) 5'-GCATTGCAGGTCTCATCA C, (înapoi) 5'-CTTGGTGTAGAACTGTTTGAC; proliferator de peroxizom - receptor activat (PPAR) γ, (înainte) 5'-GAGTGTGACGACAAGATTTG, (înapoi) 5'-ATAGTGGAAGCCTGATGC; factor de necroză tumorală (TNF) -α, (înainte) 5'-TGCCTATGTCTCAGCCTC, (înapoi) 5'-ACTCCTCCCAGGTATATG; resistin, (for-ward) 5′-TGTGGGACAGGAGCTAATAC, (înapoi) 5′-AGACATCTCTGGAGCTACAG; leptină, (înainte) 5'-CCAAAACCCTCATCAAGACC, (înapoi) 5'-GTCCAACTGTTGAAGAATGTCCC; și adiponectină, (înainte) 5'-GGATGCTACTGTTGCAAG, (înapoi) 5'-CATGTACACCGTGATGTG.

Izolarea primară a adipocitelor și absorbția glucozei.

Tampoanele de grăsime au fost excizate și adipocitele izolate de la șoareci hrăniți C57BL/6J sau C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- prin digestie cu colagenază (tip 1; Worthington, Lakewood, NJ). Suspensia celulară a fost strecurată și apoi spălată de trei ori în Krebs Ringer (118 mmol/l NaCl, 5 mmol/l NaHCO3, 4,7 mmol/l KCl, 1,2 mmol/l KH2PO4, 1,2 mmol/l MgSO4 · 7 H2O, 25 mmol/l HEPES, 2,5 mmol/l CaCl2, suplimentat cu 1% BSA, Fracțiunea V și 200 nmol/l adenozină (Sigma), pH 7,4 Suspensii celulare omogene triplicate au fost preincubate timp de 15 minute la 37 ° C într-o baie de apă cu agitare cu sau fără insulină (5 nmol/l, Humulin S; Lilly) sau 10 μmol/l citocalasin B (Sigma) pentru a determina absorbția bazală. Apoi, 10 μmol/l 2-deoxi glucoză rece și 2,5 μCi/ml [3 H] 2 ​​- a fost adăugat la celule timp de încă 3 minute absorbția de deoxiglucoză (Amersham, Buckinghamshire, Marea Britanie). A fost determinată absorbția glucozei în adipocite pe un contor de scintilație β (Wallac, Turku, Finlanda) după centrifugarea adipocitelor prin ulei de corning și omogenizare și 1 ml Triton X-100.

Analize statistice.

Inducerea UCP-2 în țesutul adipos pe o dietă bogată în grăsimi a fost asociată cu rezistența obezității la șoarecii A/J și nu apare la șoarecii C57BL/6J predispuși la obezitate (30). Șoarecii 11β-HSD-1 -/- au prezentat o inducție mediată în grăsimi a UCP-2 selectiv în țesutul adipos visceral, care a fost mai mare decât cea observată la șoarecii MF-1 de tip sălbatic (Fig. 3B). Mai mult, la șoarecii 11β-HSD-1 -/- care au fost încrucișați înapoi de 10 generații pe fundalul genetic C57BL/6J predispus la diabet/obezitate (vezi mai jos), homozigoza pentru deficitul de 11β-HSD-1 a conferit o UCP cu grăsime viscerală mai mare Nivelul -2 ARNm la tulpina C57BL/6J pe dieta de control și a promovat un răspuns inductiv UCP-2 la hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi la șoarecii C57BL/6J (Fig. 3C) similar cu cel observat la șoarecii A/J rezistenți la obezitate ( 30).

Deficitul de 11β-HSD-1 determină sensibilizarea adiposă la insulină.

Deoarece profilul expresiei genei adipoase a indicat sensibilizarea insulinei în acest țesut, am evaluat parametrii funcționali ai țesutului adipos la șoarecii 11β-HSD-1 -/-. Șoarecii 11β-HSD-1 -/- au avut acizi grași plasmatici cu jeun mai scăzut (0,57 ± 0,1 față de tip sălbatic 0,9 ± 0,14 mmol/l, șoarecii P -/- au prezentat o absorbție mai ridicată a glucozei bazată pe insulină (5 nmol/l) decât martorii de tip sălbatic (Fig. 4), confirmând direct sensibilitatea crescută la insulină adiposă.

Deficitul de 11β-HSD-1 la tulpina C57BL/6J predispusă la obezitate și diabet.

Deoarece șoarecii MF-1 au prezentat rezistență intrinsecă la obezitate, alela nulă 11β-HSD-1 a fost retrosversată pe tulpina C57BL/6J predispusă la boală obeză și metabolică (10 generații) pentru a permite investigarea efectelor deficitului de 11β-HSD-1 pe un model bine stabilit de obezitate dietetică și complicațiile sale metabolice (21,30). Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au menținut ratele normale de fertilitate, sănătate și supraviețuire, după cum s-a documentat anterior pe fundalul MF-1 (15).

Șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic cărora li s-a administrat o dietă bogată în grăsimi timp de 18 săptămâni au devenit în mod evident obezi (Fig. 5A). Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au câștigat în mod semnificativ mai puțină greutate pe dieta bogată în grăsimi (Fig. 5A), în ciuda unui aport caloric crescut față de șoarecii C57BL/6J (Fig. 5B). Acest lucru ar putea fi parțial explicat de temperatura crescută a corpului miezului (Fig. 5C), sugerând o rată metabolică mai mare la șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/-. Ca și în cazul șoarecilor MF-1-11β-HSD-1 -/-, șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au acumulat semnificativ mai puțină grăsime viscerală (ajustată în funcție de greutatea corporală) (Fig. 5D), cu o grăsime relativ mai mare masă redistribuită în grăsimi epididimale metabolice mai puțin dezavantajoase cu hrană bogată în grăsimi (Fig. 5E). Modelele de expresie a genelor țesutului adipos la șoareci C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/-, inclusiv cele pentru UCP-2 (Fig. 2B-C), au fost similare cu șoarecii MF-1-11β-HSD-1 -/-, indicând faptul că mecanisme similare care stau la baza conduc fenotipul șoarecilor 11β-HSD-1 -/- pe ambele fundaluri ale tulpinii (nu este prezentat).

Ca și în cazul tulpinii MF-1, o distribuție favorabilă a adipozei a fost asociată cu o toleranță semnificativ îmbunătățită la glucoză (Fig. 6A) și cu o sensibilitate mai mare la insulină (Fig. 6B) la șoareci C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/-.

Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au un profil lipidic îmbunătățit pe dietele bogate în grăsimi și colesterogene.

Studiile anterioare au arătat că șoarecii MF-1-11β-HSD-1 -/- au avut un profil de lipide și lipoproteine ​​îmbunătățit atunci când au fost hrăniți cu o dietă standard de rozătoare (16). Cu toate acestea, studiile noastre actuale relevă tulpina MF-1 pentru a fi rezistentă la obezitate și pentru a dezvolta o intoleranță ușoară la glucoză numai cu hrana bogată în grăsimi. Prin urmare, am abordat dacă o astfel de îmbunătățire a metabolismului lipidic ar fi observată la șoarecii 11β-HSD-1 -/- rederiviți pe tulpina C57BL/6J predispusă la diabet (21,30). Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au prezentat trigliceride hrănite cu conținut ridicat de grăsimi (Fig. 7A). Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- hrăniți cu control au crescut nivelurile de colesterol HDL „benefice” (Fig. 7B). Hrănirea unei diete cu untură foarte colesterogenă timp de 6 săptămâni la șoareci de tip sălbatic C57BL/6J a produs o trecere marcată de la colesterolul HDL ateroprotector la colesterolul asociat LDL (Fig. 7C). Șoarecii C57BL/6J - 11β-HSD-1 -/- au prezentat o ameliorare a acestui comutator la colesterolul asociat LDL (Fig. 7D) și colesterolul total alimentat cu control mai mic (Fig. 7E), după cum se reflectă în contrastul HDL-cu -raportul colesterolului total (Fig. 7F).

Efectele deficitului de 11β-HSD-1 și ale susceptibilității la obezitate asupra nivelurilor de corticosteron intra-adipos.

Datele actuale reprezintă primele dovezi in vivo pentru efectele metabolice potențiale ale inhibării adiposului 11β-HSD-1. Anticipăm că deficitul adipos de 11β-HSD-1 și, prin inferență, inhibarea terapeutică a adipozei 11β-HSD-1 va îmbunătăți sensibilitatea la insulină și absorbția glucozei, va reduce lipoliza și va contracara acumularea de grăsime viscerală și anomaliile sale metabolice conexe.