Vitamina B12b îmbunătățește efectul citotoxic al DDC în culturile subconfluente de celule tumorale. (a - d) Îmbunătățirea efectului citotoxic al DDC cu 25 μM B12b către celulele HT1080, HT29, HEp-2 și A431. (e) Dependența efectului citotoxic al combinației de 1 mM DDC + 25 μM B12b față de culturile subconfluente de celule HEp-2 de timpul de expunere. Componentele (B12b și DDC) au fost adăugate simultan la 24 de ore după însămânțarea celulelor. Acțiunea DDC + B12b a fost întreruptă prin înlocuirea mediului de cultură cu un mediu de creștere proaspăt. Citotoxicitatea a fost estimată la 48 de ore după adăugarea de DDC și B12b (vezi Materiale și metode). Incubație cu DDC 1 mM (cercuri deschise) și cu DDC + B12b (cercuri umplute). Datele sunt mijloacele ± s.e.m. din cinci experimente separate.

Vacuolizarea celulelor HEp-2 în stadiul inițierii morții prin combinația de 1 mM DDC + 25 μM B12b. (a) Control (b) după 5 h-incubare a celulelor cu DDC 1 mM; (c) și (d) după incubări de 3 și 5 ore cu DDC + B12b. Săgețile indică vacuolele din celulele tratate cu DDC + B12b. Microscopie cu contrast de fază. (a ’), (b’), (c ’) și (d’): zone selectate mărite în inserțiile (a), (b), (c) și (d).

Modificări ale ultrastructurii celulelor HEp-2 cauzate de incubație timp de 4 ore în mediul de cultură conținând DDC 1 mM și B12b 25 μM. (a) Ultrastructura unei celule de control. Zone selectate mărite în inserțiile a, b și c. Barele la scară: 3 μm în imagine, 1 μm în a și b și 0,5 μm în c. (b) Ultrastructura unei celule cu modificări moderate după incubare. Barele la scară: 2 μm în imagine și 1 μm în serie. (c) Ultrastructura unei celule cu modificări severe după incubare. Pentru a distinge celula de spațiul extracelular, membrana plasmatică a celulei este marcată cu o linie punctată. Barele de scalare: 2 μm în imagine și 0,5 μm în inserția din stânga și în serie. N, nucleu; n, nucleol; ER, reticul endoplasmatic; G, aparat Golgi; m, mitocondrii; g, granule de glicogen; fl, lizozomi secundari; afl, autofagolizozomi; v, saci ER de tip vacuol.

Absența semnelor de apoptoză în timpul inițierii morții celulare printr-o combinație de 1 mM DDC cu 25 μM B12b. (a) Inhibarea activității caspazei-3 în celulele HEp-2 incubate cu DDC + B12b. Ca un control pozitiv, proteina recombinantă din TRAIL a crescut semnificativ activitatea caspazei 3. (b) Absența fragmentării ADN-ului internucleozomal în celulele HEp-2 tratate prin combinația DDC + B12b. 1 - celule de control netratate; 2 - celule după 24 de ore de incubație cu o combinație de 1 mM ditiotrietol + 25 μM B12b, care provoacă apoptoză [18] (control pozitiv); 3 - celule după 24 de ore de incubație cu DDC + B12b; 4 - markeri de greutate moleculară. (c) Inhibitorul pan-caspazei zVAD.fmk nu a protejat celulele de moarte indusă de combinația DDC + B12b. zVAD.fmk (50 μM) a fost adăugat la mediul de cultură cu 1,5 ore înainte de adăugarea DDC + B12b timp de 6 ore, după care mediul a fost înlocuit cu unul proaspăt și apoi după cultivarea de 48 de ore s-a evaluat citotoxicitatea. Datele sunt mijloacele ± s.e.m. din trei experimente separate.

Imagini microscopice confocale ale vacuolizării mediate de ER a celulelor HEp-2 (a - c) și A549 (d - f) după 6 ore de incubație cu 1 mM DDC + 25 µM B12b. (a), (d) celule de control; (b), (e) celule incubate timp de 6 ore cu DDC 1 mM; (c), (f) celule incubate timp de 6 ore cu DDC + B12b. Colorare cu H342 (1 μg/ml), ER-Tracker Red (1 μM) și LysoTracker Green (0,2 μM).

Imagini microscopice confocale ale celulelor HEp-2 colorate cu Mitotracker Green (0,2 µM), ER-tracker Red (1 µM) și H342 (1 µg/mL). (a) Control; (b) celule după incubare de 5 ore cu 1 mM DDC și (c) cu 1 mM DDC + 25 μM B12b. Membranele vacuolelor care au apărut în celule au fost colorate cu tracker ER roșu, dar nu cu Mitotracker verde.

Creșterea concentrației de Ca 2+ intracelular în timpul inițierii morții celulare prin combinația de 1 mM DDC + 25 μM B12b și efectul inhibitorului receptorului IP3 și al chelatorului de calciu extracelular asupra citotoxicității combinației. (a) și (b) fluorescența FL1 a celulelor colorate cu 5 μM Fluo-4AM după incubare cu DDC și B12b. (c) Efectul inhibitorului receptorului IP3 și al EGTA asupra inițierii morții celulare prin combinația de DDC + B12b și vacuolizare celulară (d - i). Celulele au fost incubate în mediu de creștere timp de 90 de minute cu 2-APB 20 μM sau cu 2,5 mM EGTA, apoi s-a adăugat DDC + B12b și, după incubare de 6 ore, mediul a fost înlocuit cu un mediu de creștere proaspăt, fără aditivi. Citotoxicitatea a fost estimată la 48 de ore după tratament, comparativ cu martorul. *, p d), 2,5 mM EGTA (e), 20 μM 2-APB (f); DDC + B12b (g), EGTA + DDC + B12b (h) și 2-APB + DDC + B12b (i). Săgețile indică vacuole.

O schemă ipotetică a evenimentelor intracelulare în timpul inițierii morții celulelor tumorale asemănătoare paraptozei prin combinația DDC + B12b (pentru detalii, a se vedea textul).

Abstract

biomolecule

Vitamina B12b îmbunătățește efectul citotoxic al DDC în culturile subconfluente de celule tumorale. (a - d) Îmbunătățirea efectului citotoxic al DDC cu 25 μM B12b către celulele HT1080, HT29, HEp-2 și A431. (e) Dependența efectului citotoxic al combinației de 1 mM DDC + 25 μM B12b față de culturile subconfluente de celule HEp-2 de timpul de expunere. Componentele (B12b și DDC) au fost adăugate simultan la 24 de ore după însămânțarea celulelor. Acțiunea DDC + B12b a fost întreruptă prin înlocuirea mediului de cultură cu un mediu de creștere proaspăt. Citotoxicitatea a fost estimată la 48 de ore după adăugarea de DDC și B12b (vezi Materiale și metode). Incubație cu DDC 1 mM (cercuri deschise) și cu DDC + B12b (cercuri umplute). Datele sunt mijloacele ± s.e.m. din cinci experimente separate.

Vacuolizarea celulelor HEp-2 în stadiul inițierii morții prin combinația de 1 mM DDC + 25 μM B12b. (a) Control (b) după 5 h-incubare a celulelor cu DDC 1 mM; (c) și (d) după incubări de 3 și 5 ore cu DDC + B12b. Săgețile indică vacuolele din celulele tratate cu DDC + B12b. Microscopie cu contrast de fază. (a ’), (b’), (c ’) și (d’): zone selectate mărite în inserțiile (a), (b), (c) și (d).

Modificări ale ultrastructurii celulelor HEp-2 cauzate de incubație timp de 4 ore în mediul de cultură conținând DDC 1 mM și B12b 25 μM. (a) Ultrastructura unei celule de control. Zone selectate mărite în inserțiile a, b și c. Barele la scară: 3 μm în imagine, 1 μm în a și b și 0,5 μm în c. (b) Ultrastructura unei celule cu modificări moderate după incubare. Barele la scară: 2 μm în imagine și 1 μm în serie. (c) Ultrastructura unei celule cu modificări severe după incubare. Pentru a distinge celula de spațiul extracelular, membrana plasmatică a celulei este marcată cu o linie punctată. Barele de scalare: 2 μm în imagine și 0,5 μm în inserția din stânga și în serie. N, nucleu; n, nucleol; ER, reticul endoplasmatic; G, aparat Golgi; m, mitocondrii; g, granule de glicogen; fl, lizozomi secundari; afl, autofagolizozomi; v, saci ER de tip vacuol.

Absența semnelor de apoptoză în timpul inițierii morții celulare printr-o combinație de 1 mM DDC cu 25 μM B12b. (a) Inhibarea activității caspazei-3 în celulele HEp-2 incubate cu DDC + B12b. Ca un control pozitiv, proteina recombinantă din TRAIL a crescut semnificativ activitatea caspazei 3. (b) Absența fragmentării ADN-ului internucleozomal în celulele HEp-2 tratate prin combinația DDC + B12b. 1 - celule de control netratate; 2 - celule după 24 de ore de incubație cu o combinație de 1 mM ditiotrietol + 25 μM B12b, care provoacă apoptoză [18] (control pozitiv); 3 - celule după 24 de ore de incubație cu DDC + B12b; 4 - markeri de greutate moleculară. (c) Inhibitorul pan-caspazei zVAD.fmk nu a protejat celulele de moarte indusă de combinația DDC + B12b. zVAD.fmk (50 μM) a fost adăugat la mediul de cultură cu 1,5 ore înainte de adăugarea DDC + B12b timp de 6 ore, după care mediul a fost înlocuit cu unul proaspăt și apoi după cultivarea de 48 de ore s-a evaluat citotoxicitatea. Datele sunt mijloacele ± s.e.m. din trei experimente separate.

Imagini microscopice confocale ale vacuolizării mediate de ER a celulelor HEp-2 (a - c) și A549 (d - f) după 6 ore de incubație cu 1 mM DDC + 25 µM B12b. (a), (d) celule de control; (b), (e) celule incubate timp de 6 ore cu DDC 1 mM; (c), (f) celule incubate timp de 6 ore cu DDC + B12b. Colorare cu H342 (1 μg/mL), ER-Tracker Red (1 μM) și LysoTracker Green (0,2 μM).

Imagini confocale de microscopie ale celulelor HEp-2 colorate cu Mitotracker Green (0,2 µM), ER-tracker Red (1 µM) și H342 (1 µg/mL). (a) Control; (b) celule după incubare de 5 h cu DDC 1 mM și (c) cu DDC 1 mM + 25 μM B12b. Membranele vacuolelor care au apărut în celule au fost colorate cu tracker ER roșu, dar nu cu Mitotracker verde.

Creșterea concentrației de Ca 2+ intracelular în timpul inițierii morții celulare prin combinația de 1 mM DDC + 25 μM B12b și efectul inhibitorului receptorului IP3 și al chelatorului de calciu extracelular asupra citotoxicității combinației. (a) și (b) fluorescența FL1 a celulelor colorate cu 5 μM Fluo-4AM după incubare cu DDC și B12b. (c) Efectul inhibitorului receptorului IP3 și al EGTA asupra inițierii morții celulare prin combinația de DDC + B12b și vacuolizare celulară (d - i). Celulele au fost incubate în mediu de creștere timp de 90 de minute cu 2-APB 20 μM sau cu 2,5 mM EGTA, apoi s-a adăugat DDC + B12b și, după incubare de 6 ore, mediul a fost înlocuit cu un mediu de creștere proaspăt, fără aditivi. Citotoxicitatea a fost estimată la 48 de ore după tratament, comparativ cu martorul. *, p d), 2,5 mM EGTA (e), 20 μM 2-APB (f); DDC + B12b (g), EGTA + DDC + B12b (h) și 2-APB + DDC + B12b (i). Săgețile indică vacuole.

O schemă ipotetică a evenimentelor intracelulare în timpul inițierii morții celulelor tumorale asemănătoare paraptozei prin combinația DDC + B12b (pentru detalii, a se vedea textul).