Margherita T. Cantorna, Carey Munsick, Candace Bemiss, Brett D. Mahon, 1,25-Dihidroxicolecalciferol Previne and Ameliorates Symptoms of Experimental Murine Inflammatory Bowel Disease, The Journal of Nutrition, Volumul 130, Numărul 11, noiembrie 2000, paginile 2648-2652, https://doi.org/10.1093/jn/130.11.2648

ameliorează

ABSTRACT

Datele anecdotice sugerează că cantitatea de vitamina D disponibilă în mediu, fie din expunerea la soare, fie din dietă, poate fi un factor important care afectează dezvoltarea bolii inflamatorii intestinale (IBD) la om. Am testat ipoteza vitaminei D într-un model animal experimental de IBD. Șoarecii interleukinici (IL) -10 knockout (KO), care dezvoltă spontan simptome asemănătoare IBD umane, au devenit deficit de vitamina D, suficientă vitamina D sau au fost suplimentați cu vitamina D activă (1,25-dihidroxicolecalciferol). Șoarecii IL-10 KO cu deficit de vitamina D au dezvoltat rapid diaree și o boală irositoare, care a indus mortalitatea. În schimb, vitamina D - șoareci IL-10 KO suficienți nu au dezvoltat diaree, nu au risipit sau nu au murit. Suplimentarea cu 50 UI de colecalciferol (5,0 μg/zi) sau 1,25-dihidroxicolecalciferol (0,005 μg/zi) în mod semnificativ (P

Identificarea receptorilor de vitamina D din celulele mononucleare din sângele periferic a stârnit interesul timpuriu pentru vitamina D ca regulator al sistemului imunitar (Bhalla și colab. 1983; Provvedini și colab. 1983). În special, celulele CD4 + Th au receptori de vitamina D și, prin urmare, sunt ținte pentru vitamina D (Veldman și colab. 2000). Vitamina D activă hormonal [1,25-dihidroxicolecalciferol; 1,25 (OH) 2D3] a suprimat dezvoltarea a cel puțin două boli autoimune experimentale (Cantorna și colab. 1996 și 1998a). In vitro, 1,25 (OH) 2D3 a inhibat proliferarea celulelor T și a scăzut producția de interleukină (IL) -2, interferon (IFN) -γ și factor de necroză tumorală (TNF) -α (Lemire și Adams 1992). In vivo, s-a arătat că 1,25 (OH) 2D3 injecții inhibă reacția de hipersensibilitate de tip întârziată asociată cu răspunsul celulei T (Th1) helper de tip 1 (Lemire și Archer 1991, Lemire 1992). Vitamina D este un puternic regulator al sistemului imunitar în general și celulele T în mod specific.

Pentru IBD, atacul imun-mediat este împotriva tractului GI (Niessner și Volk 1995, Podolosky 1991). Celulele T, care produc în mod preferențial citokinele Th1 (IL-2, IFN-γ și TNF-α), s-au dovedit a transfera simptomele asemănătoare lui Crohn la șoareci naivi (Aranda și colab. 1997, Bregenholt și Claesson 1998) și producția de citokine Th1 este asociată cu IBD și la oameni (Niessner și Volk 1995). S-a demonstrat că tratamentul 1,25 (OH) 2D3 suprimă dezvoltarea altor boli autoimune experimentale mediate de celule T (scleroză multiplă și artrită; Cantorna și colab., 1996 și 1998a). A fost testată ipoteza că vitamina D (prin producerea de 1,25-dihidroxicolecalciferol) ar suprima dezvoltarea și progresia IBD.

Recent, au fost dezvoltate o serie de animale transgenice în care simptomele IBD apar spontan. Unul dintre cele mai bune modele animale pentru boala Crohn este șoarece IL-10 knockout (KO) (Kuhn și colab. 1993, Mac Donald 1994). În instalațiile convenționale pentru animale, șoarecii IL-10 KO dezvoltă enterocolită în 5-8 săptămâni de viață (Kuhn și colab. 1993). Aproximativ 30% din șoarecii IL-10 KO mor după apariția anemiei severe și a pierderii în greutate (Kuhn și colab. 1993). Enterocolita care se dezvoltă la șoarecii IL-10 KO se datorează unui răspuns imun necontrolat la microflora convențională, deoarece șoarecii IL-10 KO fără germeni nu dezvoltă boli. În plus, șoarecii crescuți în facilități specifice fără patogeni dezvoltă boli mai ușoare, ceea ce nu duce la moartea șoarecilor (Kuhn și colab. 1993). Există limitări implicate în studierea șoarecilor IL-10 KO ca model de IBD. Dacă vitamina D este un regulator al producției de IL-10, atunci rezultatele acestui model animal pot să nu reprezinte un răspuns imun „normal”. Cu toate acestea, pacienții cu boala Crohn prezintă simptome similare, au deprimat producția de IL-10 și au fost tratați cu succes cu IL-10 (Narula și colab. 1998).

MATERIALE ȘI METODE

Șoareci C57BL/6 IL-10 KO și sex de tip sălbatic (WT) potrivite vârstei și sexului au fost produse în colonia de reproducere a Universității de Stat din Pennsylvania; perechile reproducătoare au fost obținute de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME). Facilitățile pentru animale de la Universitatea de Stat din Pennsylvania sunt specifice fără patogeni și, prin urmare, reproducerea șoarecilor IL-10 KO a avut succes. Toate procedurile descrise au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Pennsylvania State University pe 1/25/99, numărul IACUC: 98118-A0.

Dietele

Dintr-un singur grup de femele de reproducție hrănite cu dietă comercială de șoareci (# 5105 Ralston Purina; Richmond, IN), femelele din săptămâna 2 de gestație au fost selectate și distribuite aleator în două grupuri. Hrănirea barajelor însărcinate cu o dietă deficitară în vitamina D a asigurat defrișarea vitaminei D până la vârsta de 5 săptămâni (Cantorna și colab., 1996). Toți șoarecii au fost hrăniți cu diete sintetice făcute în laborator [(Yang și colab. 1993), după cum a fost modificat din Smith și colab. (1987)]. Șoarecii au avut deficit de vitamina D, vitamina D suficientă sau 1,25 (OH) 2D3 suplimentat. Șoarecii au fost adăpostiți sub lumină galbenă pentru a preveni sinteza vitaminei D în piele. Toți șoarecii au fost deficienți în vitamina D până la înțărcare.

Șoarecii cu deficiență de vitamina D în vârstă de 3 săptămâni au fost repartizați aleatoriu în diferite grupuri de tratament, după cum este descris mai jos. Deoarece tratamentul 1,25 (OH) 2D3 al altor boli experimentale autoimune a fost cel mai eficient atunci când calciul alimentar era ridicat (1 g/100 g dietă), toți șoarecii au fost hrăniți cu diete bogate în calciu (Cantorna și colab. 1999). Dietele experimentale au fost proaspăt pregătite și înlocuite la fiecare 2-3 zile în timpul experimentului. Pentru a ne asigura că șoarecii tratați cu 1,25 (OH) 2D3 au consumat tot suplimentul furnizat, cupele cu alimente care conțin 8 g de dietă au fost înlocuite la fiecare două zile (complet consumate) pe durata fiecărui experiment (Cantorna și colab., 1996 și 1998a) . Pentru a monitoriza toxicitatea vitaminei D, șoarecii suplimentați cu 1,25 (OH) 2D3 au fost observați zilnic pentru semne de hipercalcemie, inclusiv sănătatea generală și pierderea în greutate.

Tratamente cu vitamina D.

În Experimentul 1, șoarecii cu deficiență de vitamina D în vârstă de 3 săptămâni au fost menținuți deficienți în vitamina D sau au trecut la dieta experimentală care a inclus 5,0 μg de colecalciferol/zi (suficientă vitamina D). Severitatea dezvoltării IBD a fost comparată la șoarecii cu deficit de vitamina D și cu șoareci cu vitamina D suficientă.

În experimentul 2, șoarecii cu deficiență de vitamina D în vârstă de 3 săptămâni au fost împărțiți în două grupuri. Un grup de șoareci a fost menținut pe dieta cu deficit de vitamina D, iar celălalt grup a fost suplimentat cu 0,005 μg/d 1,25 (OH) 2D3. Șoarecii cu vitamina D - deficienți și 1,25 (OH) 2D3 suplimentați au fost uciși 4 săptămâni mai târziu la vârsta de 9 săptămâni.

În experimentul 3, tratamentul 1,25 (OH) 2D3 a fost început la primele semne ale simptomelor IBD (diaree, vârsta de 7 săptămâni). Șoarecii cu deficiență de vitamina D în vârstă de 7 săptămâni au fost împărțiți în două grupuri. Un grup a fost menținut cu deficit de vitamina D, iar celălalt grup a fost suplimentat cu 0,2 μg/d 1,25 (OH) 2D3. Șoarecii au fost tratați timp de 2 săptămâni, iar șoarecii în vârstă de 9 săptămâni au fost uciși.

Restricția alimentelor.

Din cauza scăderii dramatice în greutate și a morții șoarecilor IL-10 KO cu deficit de vitamina D, s-au făcut o serie de experimente de hrănire controlată. Aceste experimente au folosit trei grupuri de șoareci. Toți șoarecii pentru aceste experimente au fost menținuți deficienți de vitamina D în primele 5 săptămâni de viață (primele semne de scădere în greutate). La 5 săptămâni, șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au fost împărțiți în două grupuri. Jumătate dintre șoareci au fost menținuți cu deficit de vitamina D, iar cealaltă jumătate au fost trecuți la o dietă suficientă cu vitamina D, care conținea 5,0 μg/d de colecalciferol. În plus, un grup de șoareci WT cu deficit de vitamina D au fost, de asemenea, trecuți la o dietă care conținea 5,0 μg/d de colecalciferol. Alimentele consumate de șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au fost cântărite zilnic, iar șoarecii cu vitamina D - IL-10 KO și WT au fost hrăniți cu o dietă restricționată care conținea cantitatea de alimente consumate de vitamina D - IL-10 deficient Șoareci KO în ultimele 24 de ore pentru a controla aportul de alimente.

Măsurătorile serice.

Șoarecii au fost sângerați la vârsta de 5 săptămâni și la sfârșitul experimentelor pentru măsurarea numărului de hemoglobină, calciu și RBC. Serul a fost obținut la fiecare 2 săptămâni și calciu seric măsurat (normal pentru șoareci este de 2,00-2,75 mmol/L). Deficitul de vitamina D a fost, de asemenea, monitorizat prin analiza calciului seric (calciu seric Kuhn și colab. 1993). Jejunul SI a fost salvat în 100 g/L de formalină în soluție de PBS și trimis la Laboratorul de Diagnostic de Stat din Pennsylvania pentru secționarea și colorarea cu hematoxialină și eozină. Patru sau mai multe secțiuni de parafină (4 μm) de la fiecare șoarece au fost punctate folosind procedura exactă descrisă de Kuhn și colab. (1993). Secțiunile au fost punctate fără cunoștința originii lor pe o scară de la 0 la 5 pentru inflamație, după cum urmează: 0, fără inflamație; 1, câteva celule inflamatorii; 2, inflamație ușoară; 3, formarea abcesului; 4, formarea abcesului cu multe celule inflamatorii în întreaga durată; și 5, inflamație masivă în întreaga secțiune.

analize statistice.

Experimentele au fost repetate după cum este necesar; acolo unde este posibil, valorile au fost raportate ca mijloace din mai multe experimente. Un test cu două eșantioane pentru proporțiile binomiale a fost utilizat pentru analiza statistică a valorilor procentuale prezentate în Figura 1 așa cum este descris (Rosner 1986). Greutatea corporală și creșterea în greutate au fost analizate prin măsurători repetate ANOVA folosind contraste simple pentru a compara grupurile de dietă (efecte principale). Datele au fost supuse ANOVA bidirecțională utilizând dieta și genotipul IL-10 ca factori de grupare. Toate comparațiile multiple post-hoc au fost făcute folosind testul Fisher Diferența cel puțin semnificativă protejat. Valorile au fost comparate folosind un program de statistici (Statview Student, Abacus Concepts, Berkeley, CA) pentru computerul Macintosh și diferențele de P Figura 1 arată că șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO încep să moară la vârsta de 7 săptămâni și la vârsta de 9 săptămâni, 58% (15/26) din șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO erau morți. După vârsta de 9 săptămâni, șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au continuat să se irosească și rata mortalității a crescut. În schimb, șoarecii cu vitamina D - IL-10 KO suficientă (n = 10) și șoarecii cu WT (n = 20) cu deficit de vitamina D au apărut sănătoși, chiar și la vârsta de 13 săptămâni.

Șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au fost întârziați în creștere, comparativ cu șoarecii WT cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO și cu vitamina D (Fig. 2) Șoarecii WT cu deficit de vitamina D au crescut mai încet decât șoarecii cu vitamina D - IL-10 KO suficienți, dar până la vârsta de 12 săptămâni, șoarecii WT cu deficit de vitamina D și IL-10 KO nu au diferit. Până la vârsta de 6 săptămâni și după aceea, șoarecii cu deficit de vitamina D - IL-10 KO au încetat să crească și erau semnificativ mai mici decât șoarecii WT cu deficit de vitamina D (Fig. 2). La vârsta de 9 săptămâni, șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au început să mănânce mai puțin și au pierdut rapid greutate suplimentară în următoarele 3 săptămâni. Experimentele ulterioare au fost încheiate la 9 săptămâni pentru a preveni durerea și suferința inutilă a șoarecilor IL-10 KO. Șoarecii IL-10 KO cu deficit de vitamina D au murit după o boală irosită, care a fost precedată de diaree.

Histopatologia vitaminei D - șoareci IL-10 KO și WT suficienți și deficienți

Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Greutate, g. Calciu seric, mmol/L. Scorul histologic .
IL-10 KO2 7 −D 12,4 ± 2,3 * 1,74 ± 0,28 * 3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO 7 1,25 (OH) 2D3 20,9 ± 0,8 3,00 ± 0,30 1,7 ± 0,4
WT 4 −D 16,7 ± 1,9 * 1,67 ± 0,32 * 0
WT 4 1,25 (OH) 2D3 21,1 ± 1,0 2,72 ± 0,25 0
Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Greutate, g. Calciu seric, mmol/L. Scorul histologic .
IL-10 KO2 7 −D 12,4 ± 2,3 * 1,74 ± 0,28 * 3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO 7 1,25 (OH) 2D3 20,9 ± 0,8 3,00 ± 0,30 1,7 ± 0,4
WT 4 −D 16,7 ± 1,9 * 1,67 ± 0,32 * 0
WT 4 1,25 (OH) 2D3 21,1 ± 1,0 2,72 ± 0,25 0

Toți șoarecii au fost deficienți de vitamina D (-D) pentru primele 5 săptămâni de viață. La 5 săptămâni, șoarecii au fost împărțiți în două grupuri; jumătate au fost suplimentate cu 0,005 μg/d 1,25 (OH) 2D3 timp de 4 săptămâni. Valorile sunt mijloace ± SEM; * semnificativ diferit de omologul suplimentat, P

IL, interleukină; KO, knockout; −D, deficit de vitamina D; 1,25 (OH) 2D3, 1,25-dihidroxicolecalciferol; WT, tip sălbatic.

Histopatologia vitaminei D - șoareci IL-10 KO și WT suficienți și deficienți

Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Greutate, g. Calciu seric, mmol/L. Scorul histologic .
IL-10 KO2 7 −D 12,4 ± 2,3 * 1,74 ± 0,28 * 3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO 7 1,25 (OH) 2D3 20,9 ± 0,8 3,00 ± 0,30 1,7 ± 0,4
WT 4 −D 16,7 ± 1,9 * 1,67 ± 0,32 * 0
WT 4 1,25 (OH) 2D3 21,1 ± 1,0 2,72 ± 0,25 0
Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Greutate, g. Calciu seric, mmol/L. Scorul histologic .
IL-10 KO2 7 −D 12,4 ± 2,3 * 1,74 ± 0,28 * 3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO 7 1,25 (OH) 2D3 20,9 ± 0,8 3,00 ± 0,30 1,7 ± 0,4
WT 4 −D 16,7 ± 1,9 * 1,67 ± 0,32 * 0
WT 4 1,25 (OH) 2D3 21,1 ± 1,0 2,72 ± 0,25 0

Toți șoarecii au fost deficienți de vitamina D (-D) pentru primele 5 săptămâni de viață. La 5 săptămâni, șoarecii au fost împărțiți în două grupuri; jumătate au fost suplimentate cu 0,005 μg/d 1,25 (OH) 2D3 timp de 4 săptămâni. Valorile sunt mijloace ± SEM; * semnificativ diferit de omologul suplimentat, P

IL, interleukină; KO, knockout; −D, deficit de vitamina D; 1,25 (OH) 2D3, 1,25-dihidroxicolecalciferol; WT, tip sălbatic.

Șoarecii WT deficienți și suficienți în vitamina D nu au prezentat semne de inflamație sau anomalii în SI. Șoarecii cu IL-10 KO deficienți de vitamina D au avut o inflamație semnificativ mai mare în SI decât omologii lor suplimentați cu 1,25 (OH) 2D3 sau vitamina D - suficienți (P Tabelul 1 și datele nu sunt prezentate). Deși șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au fost cei mai mici ca dimensiune, necropsia a arătat că au un SI extrem de mare. Experimentele viitoare vor include greutăți ale SI ca măsurători mai cantitative ale inflamației în SI.

Tratament pe termen scurt 1,25 (OH) 2D3 și severitatea IBD.

Nu au existat diferențe semnificative în greutatea oricărui șoarec după 2 săptămâni de tratament 2D3 cu 1,25 (OH) (datele nu sunt prezentate). Totuși, șoarecii cu șoareci IL-10 KO deficienți de vitamina D au fost măriți și au cântărit semnificativ mai mult (Tabelul 2). De fapt, SI de la șoareci cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO au reprezentat 9,9% din greutatea totală a corpului, care este dublu față de valoarea normală (Tabelul 2). Inflamația în SI a șoarecilor IL-10 KO a fost redusă după 2 săptămâni de tratament 2D3 cu 1,25 (OH).

Tratamentul 1,25 (OH) 2D3 scade enterocolita la șoarecii IL-10 KO

Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Intestinul subtire . g. g/100 g corp .
IL-10 KO2 8 −D 1,67 ± 0,04 * 9,9 ± 0,5 *
IL-10 KO 8 1,25 (OH) 2D3 1,08 ± 0,05 5,4 ± 0,3
WT 12 −D 0,97 ± 0,02 5,8 ± 0,2
WT 8 1,25 (OH) 2D3 1,06 ± 0,04 5,3 ± 0,2
Genotip. n. Starea vitaminei D 1. Intestinul subtire . g. g/100 g corp .
IL-10 KO2 8 −D 1,67 ± 0,04 * 9,9 ± 0,5 *
IL-10 KO 8 1,25 (OH) 2D3 1,08 ± 0,05 5,4 ± 0,3
WT 12 −D 0,97 ± 0,02 5,8 ± 0,2
WT 8 1,25 (OH) 2D3 1,06 ± 0,04 5,3 ± 0,2

Toți șoarecii au fost deficienți de vitamina D (-D) în primele 7 săptămâni de viață. La vârsta de 7 săptămâni, șoarecii cu deficiență de vitamina D - IL-10 KO încep să prezinte simptome de enterocolită (diaree și scădere în greutate). Șoarecii IL-10 KO și WT vechi de 7 săptămâni au fost împărțiți în două grupuri; jumătate au fost suplimentate cu 0,2 μg/d 1,25 (OH) 2D3 timp de 2 săptămâni. Valorile sunt mijloace ± SEM; * semnificativ mai mare decât toate celelalte grupuri, P