Yi-Chen Juan

1 Institutul de farmacologie, Universitatea Yang Ming, Taipei 112, Taiwan

administrarea

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Yao-Haur Kuo

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Chia-Chuan Chang

3 Divizia de Chimie Medicinală, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Li-Jie Zhang

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Yan-Yu Lin

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Chia-Yun Hsu

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Hui-Kang Liu

2 Divizia de medicamente pe bază de plante și produse naturale, Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză, Taipei 112, Taiwan

Abstract

Investigația actuală a încercat să confirme acțiunile benefice ale unui decoct Radix Astragali caracterizat chimic (AM-W) împotriva șobolanilor Sprague-Dawley (SD) diabetici de tip 2 (T2D). Utilizând un design caz/control, după 2 luni de tratament cu AM-W (500 mg/kg, i.p. zilnic) la șobolanii T2D au fost comparate rezultatele terapeutice. S-au demonstrat că zaharoza și polizaharidele Astragalus (ASP) există în proporții aproape egale în AM-W. Pierderea în greutate corporală, o îmbunătățire a sensibilității la insulină și o atenuare a ficatului gras după administrarea AM-W la șobolani T2D au fost evidente. În mod surprinzător, glicemia, funcția celulelor beta și toleranța la glucoză la șobolanii T2D nu s-au îmbunătățit cu tratamentul AM-W. O investigație ulterioară a indicat efectele dăunătoare ale adăugării de zaharoză (100 și 500 μg/ml) și APS (500 μg/ml) asupra secreției de insulină stimulate de glucoză și, respectiv, a viabilității. În concluzie, o doză adecvată de administrare și o reducere a conținutului de zaharoză sunt cheile maximizării meritelor acestei plante.

1. Introducere

Pentru a trata diabetul de tip 2 (T2D), atât rezistența la insulină, cât și disfuncția celulelor beta sunt doi factori patologici majori care trebuie controlați [1]. În plus, boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este puternic asociată cu totuși adesea trecută cu vederea în T2D. NAFLD necontrolat s-ar putea manifesta ulterior ca inflamație hepatică, steatoză (NASH), ciroză și chiar carcinogeneză [2].

Medicina tradițională chineză (TCM) prescrie frecvent rădăcina membranaceului Astragali (Radix Astragali (RA); Huang Qi) în formulele TCM antidiabetice pentru „suplimentarea qi” [3]. Conform cunoștințelor actuale, polizaharidele Astragalus (APSs) și saponinele sunt doi constituenți bioactivi ai RA, care s-au dovedit a fi benefici pentru intervențiile diabetului. Administrarea de APS purificate poate reduce hiperglicemia diabetică și poate duce la conservarea indirectă a funcției și a masei celulelor beta prin efecte imunomodulatoare la șoarecii diabetici de tip 1 [4, 5]. Studii recente au arătat, de asemenea, că APS-urile purificate restaurează parțial homeostazia glucozei printr-un efect sensibilizant la insulină la șoareci și șobolani T2D [6, 7] și ameliorează cardiomiopatia și nefropatia diabetică [8, 9]. Mai mult, APS-urile pot ameliora boala hepatică alcoolică grasă și stresul reticulului endoplasmatic hepatic (ER) [10, 11]. Prin urmare, se poate aștepta și la o posibilă îmbunătățire a NAFLD cu APS. Pe de altă parte, saponinele Astragalus posedă, de asemenea, activități antiglicante puternice, antioxidante și hepatoprotectoare benefice pentru terapia diabetului [12, 13].

După cum sa menționat, există o strânsă asociere între indicațiile tradiționale și dovezile farmacologice moderne ale valorii terapeutice a acestei plante împotriva diabetului. Cu toate acestea, având în vedere că extractul de apă RA (AM-W) este modalitatea tradițională de administrare, două întrebări care rămân de răspuns sunt stabilirea principiului bioactiv major în decoctul RA și dacă efectele benefice observate cu APS purificate sau saponine împotriva T2D și NAFLD pot fi aplicate direct decoctului RA.

Prin urmare, prin utilizarea șobolanilor T2D, ancheta actuală a folosit extractul de apă RA definit chimic pentru a evalua posibilele efecte asupra rezistenței la insulină, funcția celulei beta și NAFLD asociat la șobolani cu T2D.

2. Subiecte și metode

2.1. Materiale

Streptozotocina (STZ) și alte substanțe chimice au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). Insulina a fost cumpărată de la Novo Nordisk (Princeton, NJ, SUA). Reactivul TRI a fost cumpărat de la Invitrogen (Taipei, Taiwan). Acetonitrilul și metanolul (clasa LC) au fost cumpărate de la Merck (Darmstadt, Germania). Celulele H4IIE au fost achiziționate de la Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Taichung, Taiwan). Celulele BRIN-BD11 au fost obținute de la Prof. Peter R. Flatt (Universitatea din Ulster, Coleraine, Marea Britanie).

2.2. Material vegetal și prepararea extractelor RA

Rădăcinile uscate de Astragali membranaceus au fost achiziționate ca material vegetal din China și autentificate de Prof. Cum. Un specimen de voucher a fost depus la Institutul Național de Cercetare în Medicină Chineză (Taipei, Taiwan). RA (600 g) a fost tăiată și măcinată în bucăți de aproximativ 0,5 cm, apoi distilată și refluxată cu 5 L de apă distilată timp de 8 ore (h). Extractul de apă (aproximativ 2,8 L) a fost filtrat prin 6 straturi de pânză de brânză și apoi pus într-un liofilizator pentru a se obține pulbere uscată (AM-W; 198 g). În contrast, extractul de etanol a fost preparat din 100 g de RA cu 0,5 L de etanol 95% gătit la 50 ° C timp de 3 ore de trei ori. Extractul brut concentrat final (AM-E) a dat 15,2 g. Pentru a caracteriza polizaharidele, AM-W (7 g/dL) a fost supus precipitării cu un volum egal de etanol. Au fost obținute două fracții, iar stratul superior a fost colectat și concentrat ca prima fracție, AM-W-F1. Precipitatul a fost colectat prin centrifugare și a devenit AM-W-F2 (2 g de precipitat) după spălare cu etanol și acetonă înainte de uscare într-un cuptor sub vid.

2.3. Analiza chimică prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) și rezonanță magnetică nucleară (RMN)

Prin utilizarea compușilor de referință, inclusiv astragaloside I și II, izoastragaloside I și zaharoză, AM-W și AM-E au fost analizate folosind următoarele aparate și condiții: profilul HPLC a fost obținut dintr-un sistem din seria Shimadzu 10AVP echipat cu două pompe (LC -10ADVP, Shimadzu, Kyoto, Japonia), un cuptor pe coloană (CTO-10ASVP, Shimadzu), un detector de dispersie a luminii prin evaporare (ELSD) (ELSD-LT II, ​​Shimadzu), un degazator cu vid cu două canale (model 2003, Biotech AB, Onsala, Suedia), un injector automat SIL-10AVP, un controler de sistem SCL-10AVP și o stație de lucru VP de clasă pentru analiza datelor.

Procedura a folosit o coloană de separare (Cosmosil 5C18-AR-II, 5 μm, 4,6 × 250 mm ID, Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia) eluată la o rată de 0,8 ml/min sub 25 ° C. Faza mobilă a constat din apă (A) și acetonitril (B) utilizând un program de gradient de 0%

60 min. Temperatura tubului de deriva încălzit a fost de 50 ° C, iar debitul de gaz N2 a fost de 1,5 L/min pentru detectorul ELSD. Cantități egale de soluții de probă au fost filtrate prin filtre de 0,45 μm (Millipore, Bedford, MA, SUA) înainte de injecție cu un volum de 20 μL.

Pentru analiza polizaharidei și zaharozei, tehnica RMN a fost utilizată prin măsurarea spectrelor 1H RMN și 13C RMN ale probelor testate.

2.4. Generarea de șobolani dependenți de insulină diabet zaharat (IDDM) și șobolani T2D pentru administrarea AM-W

Șobolanii Sprague-Dawley (SD) au fost cumpărați de la Centrul pentru animale al Universității Naționale Yang-Ming, Taipei, Taiwan. Această cercetare a urmat Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (publicația NIH, 85-23, revizuită în 1996) și a fost aprobată de Comitetul de cercetare a animalelor de la NRICM. Șobolani SD masculi adulți cu o greutate de 250

350 g au fost adăpostite în condiții controlate (adică o temperatură a camerei de 23 ° C, umiditate controlată și un ciclu lumină/întuneric de 12/12 h). Inducerea IDDM a urmat unei descrieri anterioare [14]. Pe scurt, șobolanilor SD li s-au administrat două fotografii de STZ (100 și 50 mg/kg greutate corporală) printr-o injecție intraperitoneală (i.p.) în zilele 0 și respectiv 2. După o săptămână, șobolanii cu o glicemie în repaus alimentar> 126 mg/dL au fost considerați diabetici conform definiției diabetului de către Organizația Mondială a Sănătății. Șobolanii diabetici înfometați au primit apoi vehiculul, AM-W (500 și 1000 mg/kg), sau insulină (2 U/kg). Glicemia a fost monitorizată la fiecare 2 ore timp de până la 10 ore după tratament.

Prepararea șobolanilor T2D sa bazat pe metoda lui Sirnivasan și colab., Cu unele modificări [15]. Pe scurt, șobolanii SD au fost hrăniți cu chow bogat în grăsimi (dietă bogată în grăsimi), care a fost chow standard suplimentat cu untură suplimentară (20%, greutate/greutate), colesterol (1%, greutate/greutate) și acid colic (0,1%, w/w). După 2 săptămâni de manipulare dietetică, șobolanii cu conținut ridicat de grăsimi au fost i.p. injectat cu STZ (50 mg/kg). După 4 săptămâni, șobolanii au fost considerați diabetici dacă zahărul din sânge în post a fost> 126 mg/dL.

Paisprezece șobolani diabetici au fost împărțiți în mod aleatoriu în două grupuri și au primit fie preparat AM-W, fie ser fiziologic (ca martor al vehiculului). Zilnic i.p. administrarea a fost efectuată cu 500 mg/kg sau un volum echivalent de ser fiziologic timp de 2 luni. Nouă șobolani martor nondiabetici hrăniți cu dieta standard au primit, de asemenea, administrare zilnică de ser fiziologic.

2.5. Test de toleranță la glucoză intravenoasă (IVGTT)

După înfometarea peste noapte, glucoza (1 g/kg) a fost injectată prin vena cozii, iar zahărul din sânge a fost măsurat la 0, 15, 30, 60 și 120 min pe tot parcursul testului cu glucometre comerciale (Bioptic Technology, Taipei, Taiwan). Zona de sub curbă (ASC) a fost calculată din graficul glicemiei (mg/dL) în funcție de timp (min).

2.6. Analiza biochimică serică

Probele de sânge au fost colectate din vena cozii animalelor anesteziate cu pentobarbital (30 mg/kg, i.p.). Trigliceridele serice și colesterolul total au fost măsurate cu un analizor FUJI DRI-CHEM 3000 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japonia). Insulina serică a fost măsurată cu un kit de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (Millipore, Bedford, MA, SUA). Atât evaluarea modelului de homeostazie pentru rezistența la insulină (HOMA-IR = glicemie la jeun [mM] × insulină la jeun [μU/mL] /22,5), cât și HOMA pentru funcția celulelor beta (HOMA-B = 20 × insulină la jeun [μU/mL )]/Glicemia în jeun [mM] - 3,5) a fost calculată.

2.7. Examinări patologice

La sfârșitul experimentului, animalele anesteziate au fost sacrificate pentru a recolta ficatul. O porție de ficat a fost fixată cu 4% (greutate/volum) paraformaldehidă pentru o secțiune ulterioară de parafină sau țesut înghețat. Pentru histologia patologică calitativă, colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a fost utilizată pentru a ilustra morfologia generală. Colorarea roșu ulei O (ORO) a fost utilizată pentru a identifica conținutul neutru de lipide și acizi grași. O culoare roșie a indicat trigliceride intracelulare. Colorarea periodică a acidului Schiff (PAS) a fost efectuată pentru a determina conținutul de glicogen. O culoare purpurie indica glicogen celular.

2.8. Western Blotting

Procedura a urmat o metodologie anterioară [16]. Pe scurt, țesuturile au fost scufundate în soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața (PBS) înainte de omogenizare cu un tampon de liză rece ca gheața. Resturile de țesuturi au fost îndepărtate prin centrifugare. Cantități egale de proteine ​​(40 μg) au fost supuse separării pe dodecil sulfat de sodiu (SDS) geluri de poliacrilamidă 10%. După transferul în membranele de nitroceluloză, pete au fost blocate cu 5% (g/v) lapte degresat în soluție salină tamponată cu Tris conținând 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) timp de 1 oră și incubate cu anticorpi primari la 4 ° C peste noapte înainte de incubare timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorpul secundar. În cele din urmă, rezultatele au fost vizualizate după dezvoltarea filmului cu ajutorul unui kit de chemiluminescență îmbunătățită (ECL) (Amersham Biosciences, Uppsala, Suedia). Intensitatea bloturilor a fost cuantificată de AlphaEaseFC (Alpha Innotech, San Leandro, CA, SUA).

2.9. Analize statistice

15 min) și mediu foarte polar (t R de 15

30 min, zonele glicozidelor flavonoide), care diferă de cromatograma AM-E care prezintă vârfuri proeminente (t R de 40

55 min) și componente în zona polară joasă (t R de 45

67 min). Comparativ cu probele autentice, acest studiu a identificat în continuare vârfurile 1

3 din cromatograma AM-E ca astragaloside II, isoastragaloside I și astragaloside I. Aceste rezultate au indicat faptul că AM-E este compus în principal din saponine și flavonoide caracteristice.