Contribuție de Roger H. Unger

cardiace

Abstract

Pentru a determina mecanismul dilatației cardiace și a contractilității reduse a șobolanilor obezi Zucker Diabetic Fatty, triacilglicerolul miocardic (TG) a fost testat chimic și morfologic. TG a fost ridicat din cauza subexprimării enzimelor oxidative ale acizilor grași și a factorului de transcripție al acestora, receptorul-α activat de proliferatorul peroxizomului. Nivelurile de ceramidă, un mediator al apoptozei, au fost de 2-3 ori cele ale martorilor, iar nivelurile inductibile de oxid nitric sintază au fost de 4 ori mai mari decât în ​​mod normal. Scalarea ADN-ului miocardic, un indice de apoptoză, a atins de 20 de ori nivelul normal. Terapia cu troglitazonă a scăzut TG miocardic și ceramidă și a prevenit complet scaderea ADN-ului și pierderea funcției cardiace. În această lucrare, concluzionăm că disfuncția cardiacă la obezitate este cauzată de lipoapoptoză și este prevenită prin reducerea lipidelor cardiace.

Creșterea recentă a obezității cu debut juvenil în Statele Unite (1) prezice că următoarea generație de americani obezi vor fi obezi mai mult decât oricând. Acest lucru prezice o prevalență mai mare a complicațiilor dependente de timp ale bolii, cum ar fi rezistența la insulină, diabetul zaharat non-insulinodependent, hipertensiunea arterială, boala coronariană și alte tulburări cardiace. Etiologia acestor complicații, care sunt adesea grupate împreună sub termenul „sindrom metabolic X” (2), nu este cunoscută.

Am propus ca depunerea excesivă de triacilglicerol (TG) în țesuturile neadipozice (steatoză) mărește bazinul intracelular de acil-CoA gras, oferind astfel substrat pentru căile metabolice nonoxidative, cum ar fi sinteza ceramidei, care duc la disfuncție celulară și moarte prin apoptoză (3). Se părea posibil ca această succesiune de evenimente, stabilită în insulele pancreatice ale șobolanilor cu obezitate genetică Zucker Diabetic Fatty (ZDF) (fa/fa), să poată avea loc și în alte țesuturi, cum ar fi inima.

Boala cardiacă legată de obezitate, cea mai gravă complicație a obezității umane, este în general atribuită tulburărilor coexistente, cum ar fi boala coronariană și hipertensiunea. Disfuncția cardiacă, aritmiile, cardiomiopatia și insuficiența cardiacă congestivă sunt rareori atribuite consecințelor directe ale obezității, adică suprasolicitării cu acizi grași (FA) a miocitelor cardiace, deși literatura conține rapoarte clinice despre cardiomiopatia obezității care poate fi inversată prin scăderea în greutate (4).

Acest studiu a fost conceput pentru a testa posibilitatea ca aceleași anomalii metabolice care provoacă lipotoxicitate și lipoapoptoză în celulele β pancreatice ale șobolanilor obezi (3) ar putea compromite, de asemenea, funcția și viabilitatea celulelor miocardice. Am folosit șobolani cu obezitate care rezultă dintr-o mutație a pierderii funcției în receptorul leptinei (5, 6), șobolanul ZDF (fa/fa). Am observat în inimile lor încărcate de grăsime dovezi ale lipoapoptozei însoțite de o pierdere profundă a funcției cardiace. Aceste anomalii au fost complet prevenite prin terapia antisteatotică. Beneficiul izbitor al unei astfel de terapii asupra funcției cardiace la șobolanii obezi justifică un efort de a determina dacă există un omolog al acestei tulburări la obezitatea umană.

Materiale și metode

Animale.

Șobolani ZDF homozigoti obezi masculini (fa/fa) și tovarăși slabi de tip sălbatic (+/+) au fost crescuți în laboratorul nostru de la șobolani ZDF/Drt-fa (F10) achiziționați de la R. Peterson (Școala de Medicină a Universității Indiana, Indianapolis) ). Toți șobolanii au fost hrăniți cu chow de laborator standard (Teklad F6 8664; Teklad, Madison, WI) și li s-a dat apă de la robinet ad libitum. Genotipul lor a fost determinat așa cum este descris de Phillips și colab. (6).

La vârsta de 7 săptămâni, șobolanilor homozigoti obezi prediabetici ZDF-Drt (fa/fa) li s-a administrat chow standard pudrat cu sau fără un curs de 6 săptămâni sau 13 săptămâni de troglitazonă (TGZ; 200 mg/kg pe zi; Sankyo) . Greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate săptămânal. Șobolanii au fost sacrificați la vârsta de 14 și 20 de săptămâni. Au fost respectate orientările instituționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor.

În timp ce șobolanii se aflau sub anestezie pentobarbitală de sodiu, s-au obținut probe de sânge care nu se fixează din vena cavă inferioară. Inima a fost rapid excizată și o porțiune a ventriculului stâng a fost înghețată în azot lichid și stocată la -70 ° C pentru studii de ARNm și proteine.

La unele animale, camerele inimii au fost disecate și s-au determinat greutățile umede.

Semiquantitarea ARNm prin transcriptaza inversă - PCR.

ARN-ul total din țesutul cardiac a fost extras prin metoda de izolare TRIzol (Life Technologies, Rockville, MD). ARN-ul a fost tratat cu DNază fără RNază (Promega), iar ADNc din prima catenă a fost generat din 1 µg de ARN într-un volum de 20 µl utilizând primerul oligo (dT) în trusa de sinteză ADNc din prima catenă (CLONTECH). Primerii PCR utilizați anterior pentru acil-CoA oxidază (ACO) (7), ficat carnitin palmitoiltransferaza 1 (L-CPT-1) (8), izoforma hepatică a acetil-CoA sintetazei (8), glicerol-3-fosfat acetiltransferază (8), proteinele de decuplare (8), receptorul α (PPARα) activat de proliferatorul peroxizomului (7) și ADNc-β-actină (8) au fost din nou utilizate. Grundurile utilizate pentru oxidul nitric sintază inductibilă (iNOS) au fost 5'-CTGTGGTCACCTATCGCACC-3 '(înainte), 5'-AGCCACATCCCGAGCCATGC-3' (invers) și 5'-TAGAGGTGGTCCTCCTCTGGTGCCTGCAC-3. Nivelurile de ARNm au fost exprimate ca raportul intensității semnalului pentru genele țintă în raport cu cel pentru β-actină. Produsele PCR au fost electroforizate pe un gel de agaroză și s-a efectuat transferul Southern pe o membrană de nailon. Sondele radiomarcate specifice fiecărei molecule au fost hibridizate cu membrana și cuantificate de un aparat de fotografiat molecular (GS-363; Bio-Rad).

Analiza fragmentării ADN-ului.

Fragmentarea ADN-ului a fost testată printr-o modificare a metodei lui Duke și Sellins (9), așa cum este descris în detaliu (10).

Determinarea ceramidei.

Concentrațiile de ceramidă au fost măsurate în țesuturile cardiace proaspăt izolate de la șobolani în vârstă de 7 și 14 săptămâni printr-o modificare a testului diacilglicerol kinazei (11), așa cum este descris în detaliu (10).

Analiza concentrației de hidroxiprolină și proteine ​​din țesuturi.

S-a cântărit țesutul miocardic ventricular stâng de la șobolani slabi +/+ și obezi fa/fa ZDF la vârsta de 6 și 12 săptămâni (minim n = 5 în fiecare grup) și s-a preparat un omogenat de 5%. O probă (200 μl) de omogenat a fost hidrolizată sub vid în 6 M HCI (110 ° C, 18 ore). După reconstituirea țesutului miocardic în 2 ml de apă, concentrația de hidroxiprolină a fost determinată printr-un test colorometric. O porțiune din fiecare omogenat a fost, de asemenea, utilizată pentru a măsura concentrația de proteine ​​miocardice. Datele au fost exprimate ca raportul dintre hidroxiprolina tisulară totală în μg/g de greutate umedă și proteina tisulară în mg/g de greutate umedă.

Evaluarea ecocardiografică a ventriculului stâng.

Măsurători TG în țesuturile cardiace.

Inimile au fost disecate de la șobolani, iar apoi bucățile au fost scoase din ventriculele stângi. O soluție (500 μl) de NaCl 2 mM/20 mM EDTA/50 mM tampon fosfat de sodiu, pH 7,4, a fost adăugată la 0,5 g de ventricul stâng din care toate țesutul adipos pericardic au fost îndepărtate meticulos prin abraziune și răzuire. Apoi, 10 μl de omogenizat s-au amestecat cu 10 μl de alcool terț-butilic și 5 μl de amestec Triton X-100/alcool metilic (1: 1 vol/vol) pentru extracția lipidelor. TG-urile au fost măsurate cu un kit de diagnosticare Sigma.

Măsurători plasmatice.

Probele de sânge de șobolan au fost recoltate între orele 13:00 și 15:00. din vena cozii în tuburi capilare acoperite cu EDTA. Nivelurile de glucoză plasmatică au fost măsurate prin metoda glucozei oxidazei cu Glucose Analyzer II (Beckman Coulter). Insulina plasmatică a fost testată prin metode standard cu setul de insulină pentru șobolan Linco (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO). Acizii grași fără plasmă (FFA) au fost măsurați cu kit-ul Roche FFA (Roche Diagnostics). TG-urile plasmatice au fost măsurate prin metoda lui Danno și colab. (12).

Microscopie electronică și cuantificarea incluziunilor lipidice în mușchiul cardiac.

Fragmentele de mușchi cardiac din ventriculul stâng au fost fixate cu glutaraldehidă 2% în tampon fosfat 0,1 M (pH 7,4). După clătire în tampon fosfat, postfixare în acid osmic 1% timp de 1 oră la temperatura camerei și colorare în bloc cu acetat de uranil (13), probele au fost prelucrate pentru încorporarea epoxidică (Polybed R812; Fluka). Secțiuni subțiri au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și fotografiate într-un microscop electronic Philips CM 10 (Philips, Eindhoven, Olanda). Analiza morfometrică a fost efectuată pe cinci fragmente diferite de mușchi cardiac (șase câmpuri pe fragment) pentru fiecare animal (trei șobolani tratați cu diabet și doi șobolani tratați cu TGZ) și pe trei fragmente (șase câmpuri pe fragment) pentru fiecare animal din trei șobolani martor slabi. Densitatea volumică a incluziunilor lipidice în miocitele cardiace a fost determinată prin metoda de numărare a punctelor de la Weibel (14). Datele sunt media ± SEM a 15 probe de țesut cardiac de la animale netratate, 10 fragmente de la animale tratate cu TGZ și 9 probe de la controale slabe.

Analize statistice.

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Analizele statistice au fost efectuate folosind analiza varianței unidirecțională sau bidirecțională (ANOVA), urmată de comparația multiplă a lui Bonferroni.

Rezultate

Caracteristici metabolice la șobolani obezi ZDF (fa/fa).

Greutatea corporală medie, glicemia, insulina serică și nivelurile plasmatice ale FFA și TG ale șobolanilor obezi ZDF (fa/fa) au fost mai mari decât la controalele ZDF (+/+) masculine slabe, potrivite în funcție de vârstă, la 7, 14 și 20 de săptămâni (Tabelul 1). Nivelurile FFA au fost de 4 ori nivelurile controalelor slabe și au crescut progresiv la mai mult de 2 mM, confirmând lucrările anterioare (15). A existat o hiperglicemie ușoară postprandială la vârsta de 7 săptămâni, care a crescut progresiv la 380 ± 58 mg/dl la vârsta de 20 de săptămâni, deoarece hiperinsulinemia a scăzut de la 121 ± 11,2 microunități/ml la 59,5 ± 3 microunități/ml. La martorii slabi cu normoglicemie, insulina plasmatică a avut în medie 8,2 ± 1,2 microunități/ml.

Nivelurile plasmatice de lipide, glucoză și insulină la șobolanii slabi (+/+) și obezi (fa/fa) ZDF

Caracteristici cardiace la șobolani obezi ZDF (fa/fa).

Greutatea inimii și a ventriculilor acesteia a fost mai mare la șobolanii obezi fa/fa decât la martorii slabi +/+ la toate vârstele studiate, dar doar diferența de greutate a ventriculului stâng a fost semnificativă statistic (Tabelul 2). Ecocardiografia a relevat o diferență semnificativă a dimensiunii camerei sistolice finale între cele două grupuri la vârsta de 20 de săptămâni (P Vezi acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Greutăți cardiace și măsurători ecocardiografice la șobolani slabi (+/+) și obezi (fa/fa) ZDF la vârsta de 20 de săptămâni

Imagini ecocardiografice de la un șobolan slab normal ZDF (+/+) la vârsta de 20 de săptămâni și un șobolan obez ZDF (fa/fa) obez cu vârsta. Liniile punctate reprezintă zona cavității pentru diastola finală (stânga) și sistola finală (dreapta). Ambele zone end-diastolice și end-sistolice sunt mult mai mari la șobolanul fa/fa, indicând un ventricul dilatat cu contracție sistolică subnormală.

Relația anomaliilor cardiace cu conținutul TG miocardic.

ARNm miocardic al L-CPT-1 (B) și ACO (C), enzime ale oxidării FA și factorul de transcripție al acestora, PPARα (D) și o enzimă de esterificare a FA, GPAT (A). Valorile ARNm au fost semiquantificate prin transcriptază inversă - PCR și s-au normalizat pentru ARNm de β-actină.

Dovezi ale apoptozei miocardice.

Pereche de secțiuni subțiri ale miocardului unui șobolan ZDF (fa/fa) netratat (fa/fa) în vârstă de 18 săptămâni (stânga) și un șobolan ZDF obez (fa/fa + TGZ) tratat cu TGZ (dreapta). Rețineți reducerea picăturilor de lipide (|) și animale tratate cu TGZ. Evaluarea cantitativă a acumulării de lipide este prezentată în Fig. 5b.

Discuţie

Dovezile de aici sugerează puternic o legătură cauzală între steatoză și disfuncția cardiacă. TG-urile în sine sunt probabil inerte, dar hidroliza lor în acil-CoA gras asigură un substrat crescut pentru sinteza ceramidei. Ceramida reglează în sus expresia iNOS și crește producția de NO; se crede că creșterea rezultată a peroxinitritului provoacă apoptoza (21). Așa cum s-a constatat că lipoapoptoza din celulele β pancreatice a șobolanilor fa/fa este secundară unei creșteri a formării de ceramide de novo din supraabundența de FA neoxidate (18), la fel creșterea conținutului de ceramidă miocardică reflectă sinteza de novo. . Gradul de apoptoză miocardică și fibroza secundară însoțitoare observate în acest studiu ar putea cu siguranță să explice pierderea funcției cardiace. O relație de cauzalitate între metabolismul FA anormal și contractilitatea miocardică redusă este susținută și de faptul că TGZ, care a redus TG cardiacă, a împiedicat atât apoptoza cardiacă, cât și pierderea funcției miocardice.

Faptul că ARNm miocardic iNOS a fost mai mult de două ori normal la vârsta de 7 săptămâni și de mai mult de 4 ori normal la vârsta de 14 săptămâni crește posibilitatea ca inhibitorii iNOS să fie de asemenea utili terapeutic în prevenirea consecințelor steatozei cardiace. Am raportat că doi inhibitori iNOS, aminoguanidina și nicotinamida, ambii au prevenit complet consecințele steatozei insulelor (19). Astfel, dacă este identificat un omolog al acestei lipotoxicități cardiace, există agenți disponibili care ar trebui să fie eficienți singuri sau în combinație.

În timp ce la șobolani ZDF atât obezitatea, cât și supraacumularea ectopică a TG în țesutul neadipos sunt rezultatul unei mutații a funcției de pierdere a receptorului de leptină (5, 6), la om, obezitatea este indusă de dietă, mai degrabă decât congenitală. Anii inițiali ai obezității umane sunt, prin urmare, de obicei lipsiți de complicații, cum ar fi diabetul și bolile de inimă, sugerând că protecția sistemului antisteatotic al leptinei este eficientă încă de la început. Complicațiile pot apărea mai târziu în boală, dar rămâne de stabilit dacă acestea sunt rezultatul acelorași modificări lipotoxice observate aici la rozătoarele congenitale ale receptorilor cu leptină. Dacă da, ar indica faptul că un eșec târziu al sistemului antisteatotic apare în obezitatea indusă de dietă. Un astfel de eșec ar putea rezulta din hipoleptinemia relativă, din „supraîncărcarea sistemului”, în care fluxul de FA în țesuturile non-adipoase depășește capacitatea de manipulare a mașinilor oxidative complet reglate în sus și/sau din rezistența la leptină postreceptoare.

În prezent, majoritatea clinicienilor atribuie tulburările cardiace care apar în obezitate bolii coronariene sau hipertensiunii arteriale, deoarece acestea sunt categorii diagnostice stabilite frecvent asociate cu obezitatea. Cu toate acestea, este posibil ca boala cardiacă lipotoxică să existe, atât singură, cât și în comun, cu aceste cauze bine recunoscute ale bolilor de inimă și afectează capacitatea miocardului de a le compensa. Dacă da, terapia antisteatotică ar putea oferi un adjuvant terapeutic valoros în această tulburare umană din ce în ce mai frecventă.