Reina S. Mayor

1 Centrul de Biologie Pulmonară și Vasculară și Divizia de Medicină Neonatal-Perinatală, Departamentul de Pediatrie, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas;

pulmonare

Katelyn E. Finch

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Jordan Zehr

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Eugenia Morselli

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Michael D. Neinast

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Aaron P. Frank

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Lisa D. Hahner

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Jason Wang

3 Departamentul de patologie și pediatrie, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas

Dinesh Rakheja

3 Departamentul de patologie și pediatrie, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas

Biff F. Palmer

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Charles R. Rosenfeld

1 Centrul de Biologie Pulmonară și Vasculară și Divizia de Medicină Neonatal-Perinatală, Departamentul de Pediatrie, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas;

Rashmin C. Savannah

1 Centrul de Biologie Pulmonară și Vasculară și Divizia de Medicină Neonatal-Perinatală, Departamentul de Pediatrie, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas;

Deborah J. Clegg

2 Touchstone Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas; și

Abstract

Nutriția maternă are un impact profund pe termen lung asupra sănătății sugarului. Nutriția maternă slabă influențează dezvoltarea placentară și creșterea fetală, ducând la o greutate scăzută la naștere, care este puternic asociată cu riscul de a dezvolta boli cronice, inclusiv boli de inimă, hipertensiune, astm și diabet de tip 2, mai târziu în viață. Puține studii au delimitat mecanismele prin care nutriția maternă afectează dezvoltarea pulmonară fetală. Aici, raportăm că expunerea maternă la o dietă bogată în grăsimi (HFD) provoacă inflamații placentare, ducând la insuficiență placentară, restricție de creștere fetală (FGR) și inhibarea dezvoltării pulmonare fetale. În special, expunerea pre și postnatală la HFD maternă are ca rezultat și simplificarea alveolară persistentă în perioada postnatală. Noile noastre descoperiri oferă o asociere puternică între dieta maternă și dezvoltarea pulmonară fetală.

ipoteza Barker a stabilit că în condiții uterine, cum ar fi o nutriție slabă a mamei, dau naștere unei creșteri fetale restrânse și a unor tulburări multiorganice (2, 5). Dieta tipică americană este cea în care> 38% din calorii sunt derivate din grăsimi. Această adoptare a dietelor bogate în grăsimi a dus la o epidemie de obezitate la femeile aflate la vârsta fertilă. Important, nu s-a stabilit dacă dieta maternă, în special o dietă bogată în grăsimi (HFD), afectează dezvoltarea pulmonară fetală. Există alte componente nutriționale care s-au dovedit a avea un impact asupra dezvoltării pulmonare fetale (24, 36), dar accentul acestui manuscris se va pune pe HFD matern. Plămânul fetal este deosebit de susceptibil la insultele in utero (27). De exemplu, corioamnionita (inflamația membranelor placentare fetale) este asociată cu o dezvoltare microvasculară și alveolară redusă în plămânii ovinelor fetale (22, 23). Consumul matern de HFD induce obezitatea maternă și duce la o stare de inflamație sistemică maternă (3, 29). Cu toate acestea, nu este clar dacă inflamația sistemică maternă induce un răspuns inflamator în placentă, modificând astfel funcția placentară, creșterea fetală și dezvoltarea pulmonară.

Dietele bogate în acizi grași saturați, cum ar fi acidul palmitic, sunt asociate cu inflamația tisulară crescută prin activarea directă a sistemului imunitar înnăscut prin intermediul receptorilor de tip Toll (34). Consumul pe tot parcursul vieții de HFD duce la creșteri ale markerilor inflamatori în circulația maternă, cum ar fi amiloidul seric A3 (SAA3), o proteină reactantă în fază acută (1, 29). Mai mult, expunerea fetală la HFD maternă, independentă de obezitatea maternă și hiperinsulinemie, induce inflamația placentară și crește frecvența nașterilor mortale la primatele neumane (15).

Funcția placentară este esențială pentru creșterea fetală optimă, iar insuficiența placentară este cea mai frecventă cauză a FGR (16). FGR este o reducere patologică a potențialului de creștere a fătului (16). Este o complicație majoră a sarcinii și crește riscul de morbiditate și mortalitate fetală, perinatală și pe tot parcursul vieții (27). Recent, s-a demonstrat că HFD matern duce la o reducere a fluxului sanguin utero-placentar la primate (15), iar FGR este asociat cu modificări structurale și disfuncție celulară în plămânul fetal la ovine (33).

Deoarece inflamația placentară și FGR sunt asociate independent cu anomalii în dezvoltarea pulmonară (23, 27), am caracterizat impactul HFD matern asupra placentei și a dezvoltării pulmonare fetale. Am emis ipoteza că HFD matern induce inflamație fetal-placentară, rezultând FGR și inhibarea dezvoltării pulmonare fetale. Am căutat în continuare să determinăm mecanismul prin care HFD matern inhibă dezvoltarea pulmonară fetală. Având în vedere rolul critic al steroizilor în dezvoltarea plămânilor fetali, am evaluat influența HFD maternă asupra aspectelor căii glucocorticoide din placentă și plămâni fetale. Arătăm că HFD maternă este asociată cu dezvoltarea pulmonară fetală întârziată, precum și cu alveolarizarea postnatală și că expresia receptorului glucocorticoid (GR) este scăzută atât în ​​plăcente cât și în plămâni fetale. Acesta este primul studiu care determină un mecanism potențial prin care HFD matern inhibă dezvoltarea pulmonară fetală. Aceste descoperiri sunt extrem de importante, având în vedere creșterea epidemiei de obezitate.

MATERIALE ȘI METODE

Animale.

Toate protocoalele de studiu pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Texas (UT) Southwestern Medical Center. Șoarecii C57/Bl6 (vechi de 6–8 săptămâni) au fost cumpărați de la Laboratorul Jackson. Toți șoarecii au fost găzduiți într-un mediu controlat de temperatură în grupuri de doi până la cinci la 22-24 ° C folosind un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12-h cu acces ad libitum la apă. Șoarecii masculi au avut acces ad libitum la chow standard (nr. 2916; Harlan-Teklad). Șoarecii femele (de asemenea, cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni) au fost plasate fie pe HFD (42% din caloriile derivate din grăsimi, nr. 88137, n = 30; Harlan Teklad), fie pe chow normal (21,2% din caloriile derivate din grăsimi, 2916, n = 25; Harlan-Teklad) timp de 3-5 luni înainte de împerechere.

Împerecherea animalelor.

Bărbații și femelele nulipare au fost împerecheați timp de 36 de ore și au fost monitorizați. Creșterea în greutate a mamei a fost evaluată săptămânal. Femelele însărcinate au fost ucise în ziua embrionară 18 (E18), iar țesuturile au fost colectate.

Colecția de țesuturi.

Înainte de moarte, femeile însărcinate erau postite 3 ore. La moarte, greutatea maternă și probele de sânge au fost colectate pentru a evalua concentrațiile de glucoză și insulină în repaus alimentar. Șoarecii au fost uciși, iar placentele au fost colectate și cântărite. Porțiunile materne și fetale ale placentei au fost separate și salvate în RNAlater (Life Technologies) pentru analiza ARN, congelate rapid în azot lichid pentru analiza proteinelor sau fixate cu 4% paraformaldehidă (PFA) pentru analiza histologică. Numărul fetal a fost documentat și s-au obținut greutăți. Raportul fetal-placentar, care este o măsură a insuficienței placentare, a fost calculat prin împărțirea greutății fetale la greutatea placentară. Plămânii drept și stâng au fost disecați cu ajutorul unui microscop chirurgical de disecție și cântăriți. Plămânul fetal drept a fost fixat în 4% PFA pentru histologie sau congelat în azot lichid pentru analiza proteinelor. Plămânul fetal stâng a fost salvat în RNAlater pentru analiza ARN.

Glucoza maternă de post.

Serul a fost separat de probele de sânge integral, iar glucoza de repaus a fost determinată folosind trusa de glicemie de repaus alimentar (Millipore) conform instrucțiunilor producătorului.

Insulina maternă de post.

Probele de ser au fost analizate prin seturi de test imunosorbent enzimatic (ELISA) pentru a evalua concentrațiile de insulină (Millipore) conform instrucțiunilor producătorului.

RT-PCR cantitativ în timp real.

Țesuturile pulmonare placentare (fetale) și fetale au fost excizate și plasate rapid în ARNlater (Life Technologies). ARN-ul total a fost extras în urma omogenizării țesuturilor în Trizol (Invitrogen) folosind un TissueLyser (Qiagen) și apoi izolat folosind kitul de extracție RNeasy RNA (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea și calitatea ARN-ului au fost determinate prin absorbanță la 260/280 nm. ADNc-urile au fost preparate prin transcriere inversă 1,5 μg ARN utilizând transcriptaza inversă SuperScript III (Invitrogen) și oligo (dT) (Invitrogen). PCR-uri cantitative în timp real au fost efectuate cu primerii TaqMan pentru Nlrp3 (Mm00840904_m1), IL-1β (Mm01336189_m1), GR (Mm00433832_m1), 11β-hidroxisteroid dehidrogenază (HSD) 1 (Mm00476182_m04), Mm00476182_m099 Mm00455678_m1), SpC (Mm00488144_m1), SpD (Mm00486060_m1) și β-actină (Mm00607939_s1) pe un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7900 HT (folosind Biosystems tehnice). Cantitățile relative ale tuturor ARNm au fost calculate utilizând metoda ciclului de prag comparativ. ARNm-β-Actină a fost utilizat ca genă de referință.

Analiza proteinelor.

Histologie.

Țesuturile pulmonare fetale pentru histologie și imunohistochimie au fost excizate, cântărite și fixate în 4% PFA timp de 48 de ore și apoi clătite și depozitate în PBS. Procesarea ulterioară a parafinei, încorporarea, secționarea și colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E), precum și colorarea periodică a acidului-Schiff (PAS) pentru glicgen au fost efectuate de The Molecular Pathology Core la UT Southwestern Medical Center din Dallas așa cum a fost descris anterior 39).

Proliferarea celulelor pulmonare fetale prin imunohistochimie Ki-67.

Maturarea pulmonară fetală.

Pentru a evalua maturarea plămânului fetal, diapozitivele pulmonare fetale H&E au fost punctate de un patolog orbit de proiectarea studiului și de condițiile dietetice folosind metodele descrise anterior (8). Pe scurt, maturarea a fost notată utilizând următoarea scară: 0 = stadiul pseudoglandular al dezvoltării pulmonare (E9.5-16.0); 1 = canalicular (E16.6–17.4); 2 = canalicular/sacular terminal (E17.5-postnatal ziua 5); 3 = sacular terminal (17.4-18.2); și 4 = sacular/alveolar terminal (18,2 până după naștere). Etapa pseudoglandulară a dezvoltării pulmonare a fost caracterizată prin tubuli rotunzi căptușiți de un singur strat de epiteliu cuboidal simplu cu lumeni absenți sau mici. Etapa canaliculară a dezvoltării pulmonare a fost caracterizată prin tubuli dilatați, de formă neregulată și căptușiți cu epiteliu cuboidal și capilare aproape de tubuli. Etapa saculară terminală a dezvoltării pulmonare a fost clasificată ca având tubuli mai complecși cu muguri fără nicio căptușeală epitelială. Sacii sunt separați unul de celălalt de septe îngroșate cu pereți netezi. În stadiul alveolar al dezvoltării pulmonare, plămânul este matur, cu alveole complet dezvoltate și un endoteliu subțiat.

Gradarea glicogenului orbit.

Maturarea plămânilor în plămânii fetali la E18 a fost, de asemenea, evaluată utilizând colorarea PAS semiquantitativă pentru glicogen așa cum s-a descris anterior (7). Plămânii fetali au fost rapid excizați și înghețați rapid pentru a spori calitatea țesuturilor. Cuantificarea conținutului de glicogen citoplasmatic în plămânii fetali a fost făcută de un patolog orbit de proiectarea studiului. Protocolul de cuantificare pentru glicogen a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, intensitatea colorării glicogenului a fost notată utilizând următoarea scară: 0 = nu există colorare detectabilă; 1 = prima colorare detectabilă; 2 = granule de glicogen citoplasmatic în 60% din celule. Scorul mediu pe dietă maternă a fost apoi calculat.

Studii postnatale la pui.

Un subset de pui nou-născuți a rămas cu mamele în dietele respective până în ziua postnatală 15. Puii au fost anesteziați, abdomenul a fost deschis și animalul a fost exsanguinat prin tranziția vaselor abdominale. A fost efectuată o toracotomie, iar traheea a fost expusă. O canulă tocită a fost introdusă și legată de trahee. Plămânii au fost fixați prin umflare prin instilarea PFA tamponată cu 4% PFA la o presiune de 25 cm apă. Secțiunile pulmonare histologice au fost procesate pentru colorarea H&E așa cum s-a descris mai sus.

Analize statistice.

Distribuția datelor a fost testată pentru normalitate cu testul de normalitate Shapiro-Wilk. Mijloacele obținute din datele distribuite în mod normal au fost comparate utilizând un test t neegalat, cu două cozi, în timp ce mijloacele din datele distribuite în mod normal au fost comparate utilizând testul U Mann-Whitney. Valorile P Fig. 1A). Deși șoarecii expuși la HFD erau mai grei la momentul împerecherii, creșterea lor în greutate în timpul sarcinii a fost semnificativ mai mică decât șoarecii expuși la chow (10,0 ± 0,20 față de 13,3 ± 0,2 g, respectiv; P ≤ 0,001) (Fig. 1B). Glicemia maternă la jeun a fost crescută la șoarecii expuși la HFD față de șoarecii hrăniți (243 ± 15 vs. 178 ± 5,9 mmol/l, respectiv; P = 0,01) (Fig. 1C). În plus, nivelurile insulinei serice de post materne au fost mai mari la șoarecii expuși la HFD comparativ cu șoarecii hrăniți cu chow (1,40 ± 0,15 față de 0,94 ± 0,15 ng/ml; P ≤ 0,05) (Fig. 1D).