Laborator gastrointestinal de afiliere, Departamentul de științe clinice ale animalelor mici, Colegiul de Medicină Veterinară și Științe biomedicale, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

disbiozei

Afiliere de urgență și îngrijire critică, Departamentul de științe clinice la animale mici, Colegiul de Medicină Veterinară și Științe biomedicale, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru știința plantelor, Universitatea Penn State, University Park, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Afiliere Artie McFerrin Departamentul de Inginerie Chimică, Texas A&M University, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

Afilieri Artie McFerrin Departamentul de Inginerie Chimică, Texas A&M University, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Patogenie și Imunologie Microbiană, Texas A&M Health Science Center, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

Laborator gastrointestinal de afiliere, Departamentul de științe clinice ale animalelor mici, Colegiul de Medicină Veterinară și Științe biomedicale, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Științe Alimentare, Penn State University, University Park, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii, Institutul Penn State Hershey Cancer, Hershey, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Laborator gastrointestinal de afiliere, Departamentul de științe clinice ale animalelor mici, Colegiul de Medicină Veterinară și Științe biomedicale, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas, Statele Unite ale Americii

  • Blake C. Guard,
  • James W. Barr,
  • Lavanya Reddivari,
  • Cory Klemashevich,
  • Arul Jayaraman,
  • Jörg M. Steiner,
  • Jairam Vanamala,
  • Jan S. Suchodolski

Cifre

Abstract

Citare: Guard BC, Barr JW, Reddivari L, Klemashevich C, Jayaraman A, Steiner JM, și colab. (2015) Caracterizarea disbiozei microbiene și a modificărilor metabolomice la câinii cu diaree acută. PLoS ONE 10 (5): e0127259. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0127259

Editor academic: Daniel Monleon, Sanitary Investment Institute INCLIVA, SPANIA

Primit: 17 septembrie 2014; Admis: 14 aprilie 2015; Publicat: 22 mai 2015

Disponibilitatea datelor: Secvențele au fost depuse în Arhiva de citire a secvenței sub următorul număr de acces: SRP040310.

Finanțarea: „Autorii nu au primit finanțări specifice pentru această lucrare.”

Interese concurente: Coautorul Jan Suchodolski este membru al consiliului de redacție PLOS ONE și acest lucru nu modifică aderarea noastră la politicile și criteriile editoriale PLOS ONE.

Introducere

Materiale și metode

Înscrierea animalelor și colectarea probelor

Fecalele trecute în mod natural, probele de ser (colectate prin puncție venoasă) și probele de urină (colectate prin cistocenteză) au fost obținute de la câini sănătoși, precum și câini cu diaree acută (AD). Câinii cu AD au fost clasificați în continuare ca având diaree nehemoragică (NHD) sau diaree hemoragică (AHD) (Tabelul 1). Fecalele au fost refrigerate imediat după colectare, transferate în câteva ore într-un congelator la -80 ° C și depozitate congelate până la procesare pentru extracția ADN-ului. Probele de ser și urină au fost alicotate și depozitate congelate la -80 ° C până la procesare. Proprietarii au dat acordul scris pentru ca câinii lor să fie folosiți în acest studiu. Colectarea fecalelor, serului și urinei a fost aprobată de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Texas A&M University (IACUC): număr de protocol; 2012–101. Niciunul dintre câinii sănătoși sau câinii cu diaree acută nu a fost utilizat într-un studiu anterior [14].

Grupul de control a fost format din 13 câini de companie sănătoși (Tabelul 1, Tabelul S1). Toți câinii erau proprietate privată, trăiau în diverse medii casnice și erau hrăniți cu o varietate de diete comerciale. Niciunul dintre câini nu a avut antecedente de semne gastro-intestinale sau administrare de antibiotice cu cel puțin o lună înainte de recoltarea probelor fecale. Toți câinii sănătoși trăiau în Texas, SUA.

Grupul bolnav a fost format din 13 câini în total cu diaree acută (6 câini cu NHD și 7 câini cu AHD) care s-au prezentat la Spitalul de Predare Medicală Veterinară din Texas A&M University cu diaree acută, non-hemoragică sau hemoragică (definită ca durata diareei ) Pentru genele funcționale și ortologii lor KEGG specifici, pragul de scor LDA a fost stabilit la> 2,5 LEfSe este disponibil gratuit online în cadrul fluxului de lucru Galaxy [26, 27].

Acizi grași cu lanț scurt

Concentrațiile fecale de SCFA au fost testate pentru normalitate și comparate între fiecare grup utilizând un test Mann-Whitney U. SCFA-urile care s-au dovedit a fi semnificativ diferite între grupuri au fost apoi corelate cu grupuri bacteriene diferențiat abundente (de exemplu, corelația rangului Spearman; JMP 10, SAS software Inc.).

Metabolomica serică și urinară nedestinată

Fișierele brute Waters au fost convertite în format netCDF, iar detecția vârfului XCMS [28], alinierea timpului de păstrare și gruparea caracteristicilor au fost efectuate atât pe canalele de energie de coliziune mică, cât și de mare (MS și MSe). Seturile de date au fost separate în urma alinierii, normalizate la semnalul ionic extras total, mediat prin injecție replicată, iar fluxul de lucru idMS/MS descris a fost aplicat anterior tuturor caracteristicilor semnificative pentru generarea spectrelor MS/MS (idMS/MS) indiscriminante pentru căutarea bibliotecii și identificarea compusului [29]. Pentru identificarea spectrelor, spectrele idMS/MS recreate au fost căutate în baza de date NIST ‘12 MS/MS, Metlin și Massbank. Spectrelor idMS/MS care corespundeau spectrelor MS/MS din baza de date li s-a atribuit o încredere de identificare de nivel 2 [30]. Pentru urină, concentrațiile de compus din fiecare probă de urină au fost normalizate la concentrația de creatinină în urină și exprimate ca rapoarte. Serul a fost normalizat după volum. După prelucrarea prealabilă a datelor, analiza componentelor principale și analiza univariată au fost realizate folosind instrumentul de procesare a datelor metabolomice bazate pe web MetaboAnalyst 2.0 [31, 32].

Rezultate

Analiza secvențierii

Conducta de analiză a obținut 297.315 secvențe de calitate pentru cele 19 probe analizate (medie ± deviație standard [a tuturor probelor] = 9.013 ± 1.203). Figura 1 ilustrează curba de rarefacție pentru speciile observate (un număr al tuturor unităților taxonomice operaționale unice (OTU)). Toate măsurile de diversitate alfa sunt rezumate în Tabelul 1. Speciile observate au fost reduse semnificativ la câinii cu diaree acută (p = 0,0218). Indicele Shannon a scăzut semnificativ la câinii cu AD și NHD în comparație cu câinii sănătoși (p = 0,0033 și p Fig. 1. Analiza rarității secvențelor genei 16S rRNA obținute din probe de fecale canine.

Liniile reprezintă media, iar barele de eroare reprezintă abateri standard. Analiza a fost efectuată pe un subset selectat aleatoriu de 6.900 secvențe per probă. NHD = diaree acută nehemoragică; AHD = diaree acută hemoragică.

Comunități microbiene

Graficele PCoA (Fig. 2) pe baza distanțelor Unifrac neponderate au arătat diferențe semnificative între câinii sănătoși și câinii cu AD (ANOSIM; p = 0,0040). În plus, câinii cu NHD și câinii cu AHD au diferit semnificativ de câinii sănătoși (ANOSIM; p = 0,0020 pentru ambii). Cu toate acestea, nu a existat nicio diferență în comunitățile microbiene între câinii cu diaree hemoragică și non-hemoragică. Pe baza mărimii efectului LDA (LEfSe), Clostridium spp. a fost semnificativ asociat cu AD, în timp ce Prevotella spp., Blautia spp., Faecalibacterium spp., Eubacterium spp. și genuri neclasificate din următoarele familii: Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Clostridia, Ruminococcaceae și Coprobacillaceae au fost semnificativ asociate cu câinii sănătoși (). O hartă de căldură din Fig 4 a fost folosită pentru a ilustra aceste schimbări.

Pătrate albastre = câini sănătoși, cercuri verzi = diaree acută nehemoragică (NHD) și triunghiuri roșii = diaree acută hemoragică (AHD); ANOSIM pentru câinii sănătoși vs. câini cu AD (NHD și AHD combinate), p = 0,0040; și ANOSIM pentru NHD sau AHD vs. câini sănătoși, p = 0,0020 pentru ambii.

Grupuri diferențiat abundente între câinii sănătoși și câinii cu diaree acută. Barele roșii reprezintă grupuri bacteriene asociate cu câinii cu diaree acută, în timp ce barele verzi reprezintă grupuri bacteriene asociate cu câinii sănătoși.

Sănătos = câini sănătoși; NHD = diaree acută nehemoragică; AHD = diaree acută hemoragică. - Neclasat. denotă un gen neclasificat în cadrul taxonilor respectivi.

Tabelul 2 și Fig. 5A rezumă diferențele în grupurile bacteriene între grupurile de boală. Secvențele aparținând filumului Bacteroidetes au fost semnificativ scăzute la câinii cu AD comparativ cu câinii sănătoși (p = 0,0280). Secvențele aparținând genului Faecalibacterium și unui gen neclasificat din Ruminococcaceae au fost ambele scăzute semnificativ la câinii cu AD comparativ cu câinii sănătoși (p = 0,0319 și, respectiv, 0,0368). Secvențele aparținând genului Clostridium au fost semnificativ crescute la câinii cu AD comparativ cu câinii sănătoși (p = 0,0476). Nu au fost identificate diferențe între câinii cu diaree acută hemoragică și nehemoragică la evaluarea grupurilor bacteriene.

Diaree acută = ambele grupuri combinate (NHD și AHD). Barele reprezintă valoarea mediană pentru fiecare grup. Valorile P ajustate pe baza ratei de descoperire falsă a lui Benjamini și Hochberg.

PCR cantitativă

Abundența de Clostridium perfringens a fost semnificativ crescută la câinii cu AD (mediana log ADN [interval]: 7 [5,8-7,5]) comparativ cu câinii sănătoși (median log ADN [interval]: 4,6 [3-6,1]; p = 0,0088) . Clostridium perfringens a fost, de asemenea, semnificativ crescut la subgrupul de câini cu AHD (log ADN median [interval]: 7,1 [6,9-7,4]) comparativ cu câinii sănătoși (p 2,5). Următoarele căi au fost asociate cu diaree acută: degradarea benzoatului în cadrul biodegradării/metabolismului xenobioticelor, metabolismul lipidelor, sistemul cu două componente în transducția semnalului, ansamblul flagelar/proteine ​​de motilitate bacteriană/chemotaxie bacteriană în cadrul motilității celulare și metabolism. Următoarele căi au fost asociate cu câinii sănătoși: metabolismul metanului/fosforilarea oxidativă în metabolismul energetic și chaperonii/catalizatorii pliabili în cadrul sortării/degradării pliante.

H .__ = Sănătos, A .__ = diaree acută non-hemoragică, R .__ diaree acută hemoragică.

Acizi grași cu lanț scurt

Acidul butiric, acidul acetic și acidul propionic au fost fiecare exprimate ca procent din cantitatea totală de concentrații fecale de SCFA (Fig. 7). Proporția de acid propionic a fost semnificativ redusă la câinii cu AD (mediană [interval]: 12% [0-25%]) comparativ cu câinii sănătoși (mediană [interval]: 30% [20-44%]; p = 0,0033) . În schimb, proporția de acid butiric a fost semnificativ crescută la câinii cu AD (mediană [interval]: 12% [8-26%]) comparativ cu câinii sănătoși (mediană [interval]: 6% [4-8%]; p = 0,0048). Nu au existat diferențe semnificative în concentrațiile totale de SCFA sau BCFA fecale (μmol/g de fecale uscate) observate între grupurile de câini (tabelul S3).

Cercuri = câini sănătoși; Pătrate = diaree acută ambele grupuri combinate (NHD și AHD). Barele reprezintă valoarea mediană pentru fiecare grup. Valorile P ajustate pe baza ratei de descoperire falsă a lui Benjamini și Hochberg.

Corelații între SCFA și grupurile bacteriene

S-a observat o corelație pozitivă între acidul propionic și un gen neclasificat din Ruminococcaceae, precum și Faecalibacterium (ρ = 0,8377 [p = 0,0042] și ρ = ​​0,6725 [p = 0,0332], respectiv) (Fig. 8). S-a descoperit că acidul butiric are o corelație negativă cu un gen neclasificat din Ruminococcaceae (ρ = -0,8265 [p = 0,0027]. Mai mult, acidul propionic a fost corelat negativ cu Lactobacillus (ρ = -0,8333 [p = 0,0424]).

A) Corelații între acidul butiric și anumite grupe bacteriene. B) Corelații între acidul propionic și anumite grupe bacteriene.

Metaboliți serici și urinari

Graficele PCA nu au prezentat nicio agregare în profilurile metabolitelor serice sau urinare (figurile 9 și respectiv 10) între câinii sănătoși și câinii cu diaree acută. Un total de 82 de compuși unici au fost identificați în ser, în timp ce 362 de compuși unici au fost identificați în urină. Dintre acești compuși, niciunul nu a fost modificat semnificativ după ajustarea pentru comparații multiple în oricare dintre tipurile de probe analizate. Cu toate acestea, în ser, valorile p neajustate au arătat că concentrația de acid kinurenic în ser a fost semnificativ redusă la câinii cu diaree acută comparativ cu câinii sănătoși (p = 0,0048). În plus față de această comparație, a fost comparat raportul dintre concentrația de acid kinurenic (K) și triptofan (T) în serul câinilor sănătoși și al câinilor cu diaree acută. Raportul K/T a fost semnificativ redus la câinii cu diaree acută (p = 0,0036).

A) Diagrama de analiză a componentelor principale în care punctele roșii reprezintă câinii cu diaree acută, în timp ce punctele verzi reprezintă câinii sănătoși. Elipsele arată distribuția de încredere de 95% pentru fiecare grup. B) Concentrația relativă de acid kinurenic, triptofan și raportul lor între ele în ser (p = 0,0048, 0,8282 și respectiv 0,0036; respectiv).

A) Diagrama de analiză a componentelor principale în care punctele roșii reprezintă câinii cu diaree acută, în timp ce punctele verzi reprezintă câinii sănătoși. Elipsele arată distribuția de încredere de 95% pentru fiecare grup. B) Concentrația relativă de 2-metilindol și 5-metoxi-1H-indol-3-carbaldehidă în ser (p = 0,0185 și, respectiv, 0,0330).

În urină, valorile p neajustate au arătat că concentrațiile de 2-metil-1H-indol și 5-metoxi-1H-indol-3-carbaldehidă au fost semnificativ reduse la câinii cu diaree acută comparativ cu câinii sănătoși (p = 0,0185 și 0,0330, respectiv).