Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, metodologie, software, validare, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

comparație

Adresa actuală: Universitatea Sichuan, Chengdu, Sichuan, China

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Metodologie

Laborator cheie de afiliere pentru biotehnologia furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de Cercetare a Furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Arhivarea datelor, Software

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Investigarea rolurilor, administrarea proiectelor, supravegherea

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Analiză formală, investigație

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Conceptualizare, Metodologie, Administrarea proiectelor, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

  • Tao He,
  • Haijun Zhang,
  • Jing Wang,
  • Shugeng Wu,
  • Hongyuan Yue,
  • Guanghai Qi

Cifre

Abstract

Făina de semințe de bumbac (CSM) este frecvent utilizată în dietele găinilor pentru a înlocui făina de soia (SBM). Cu toate acestea, consecințele moleculare ale acestei substituții rămân neclare. Pentru a investiga impactul acestei substituții la nivel molecular, iTRAQ combinat cu analiza biochimică a fost efectuat la găinile Hy-Line W-36 suplimentate cu o dietă mixtă de CSM și SBM. Greutatea ouălor, înălțimea albuminei și unitatea Haugh au fost reduse semnificativ în grupul CSM100 (100% proteină brută din SBM înlocuită cu CSM) comparativ cu grupul SBM (P Tabelul 1. Compoziție și niveluri de nutrienți ai dietelor găinii ouătoare de la 40 la 51 săptămâni de varsta.

Performanță, calitatea albuminei și colecția de mostre

Performanța și parametrii calității albuminei au fost evaluați în timpul procesului de hrănire de 40-51 săptămâni. Greutatea corporală medie a găinilor ouătoare a fost de 1,76 ± 0,2 kg la începutul studiului. Consumul de furaje și raportul de conversie a furajelor (FCR, furaj/ou, g/g) au fost măsurate la fiecare două săptămâni, iar producția de ouă, greutatea ouălor și mortalitatea au fost înregistrate zilnic.

Cinci ouă au fost colectate din fiecare replică la sfârșitul studiului de hrănire pentru a determina indicii de calitate a albuminei. Înălțimea albuminei și HU au fost determinate cu Egg Analyzer (ORKA Food Technology Ltd, Ramat Hasharon, Israel). Toate rezultatele au fost obținute la temperatura camerei.

La sfârșitul săptămânii 51, o găină ouătoare din fiecare replică a fost selectată aleatoriu. Sângele a fost colectat prin vena aripii și centrifugat la 3000 × g timp de 10 minute pentru recoltarea serului, care a fost apoi depozitat la –20 ° C până la analiză. Straturile au fost imediat sacrificate prin dislocarea colului uterin. Magnamul oviductului a fost excizat și fixat în 10% formalină neutră tamponată (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Beijing, China), respectiv.

Evaluarea morfologiei Oviduct magnum și analiza hormonilor

Pentru studii histopatologice, probele de oviduct fixat în formalină (magnum) au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Toți reactivii utilizați au fost de calitate analitică (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. Beijing, China). Modificările histopatologice au fost examinate cu un microscop cu lumină (BX51, Olympus Corp., Tokyo, Japonia). Evaluarea histopatologică a fost efectuată de personal calificat la Departamentul de Patologie Veterinară de la Universitatea de Agricultură din Beijing. Concentrațiile plasmatice de progesteron și estrogen au fost analizate folosind iod [125I] estradiol și un kit de radioimunologie de progesteron (Beijing North Institute of Biological Technology, Beijing, China).

Digestia cu tripsină și etichetarea iTRAQ

Analiza prin spectrometru de masă Q-Exact și procesarea datelor

Interpretarea și cuantificarea datelor

Pentru prelucrarea datelor, am folosit software-ul Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) pentru a interpreta fișierele de date brute produse prin spectrometrie de masă. Baza de date cu proteine ​​CHICK a fost descărcată din baza de date NCBI și combinată cu secvențele inversate și secvențele de contaminanți răspândiți pe scară largă, cum ar fi cheratinele umane. Parametrii pentru căutarea bazei de date au fost după cum urmează: tripsina a fost selectată ca enzimă; două clivaje ratate au fost permise la maximum; toleranța de masă a precursorului a fost setată la 15 ppm; toleranța de masă a fragmentului a fost setată la 20 mmu; carbamidometilarea cisteinei a fost stabilită ca modificare fixă; oxidarea metioninei și etichetele iTRAQ 4plex la capătele N-terminale și la lanțurile laterale ale lizinei au fost permise ca modificare dinamică. S-a aplicat principiul strict de parsimonie maximă și numai meciurile din spectrul peptidic (PSM) cu încredere ridicată sau medie și cu delta Cn mai mare de 0,15 au fost luate în considerare pentru gruparea proteinelor. Vârfurile ionice au fost integrate pe baza celui mai încrezător centroid cu toleranță de 20 ppm. Prin baza de date inversă, rata de descoperire falsă a fost setată la 0,01 pentru a obține un rezultat de încredere ridicat.

Cuantificarea proteinelor a fost realizată și de software-ul Proteome Discoverer 1.2, care a calculat automat abundența relativă a peptidelor marcate cu iTRAQ și a proteinelor corespunzătoare. Numai peptidele unice și cu încredere ridicată au fost luate în considerare pentru cuantificare. Pentru a corecta tendința de pipetare sau determinarea concentrației de proteine ​​în probele mixte, toate raporturile de proteine ​​au fost normalizate de raportul mediu de proteine. Pragurile minime semnificative de reglementare au fost de 1,2. Proteinele cu raporturi ≥1,2 sau ≤0,833 sunt considerate proteine ​​exprimate diferențial.

Western blot

Concentrația de proteine ​​a supernatantului a fost măsurată prin testul de proteină Bradford. Probele care conțin 30 μg de proteine ​​totale au fost separate cu 12% (greutate/volum) SDS-PAGE și transferate pe o membrană PVDF (Millipore, Bedford, MA). După incubare timp de 1 oră cu tampon de blocare (5% (g/v) lapte degresat în TBS-T) (0,05% (v/v) Tween 20 în soluție salină tamponată Tris), membrana a fost sondată cu anticorpii primari indicați diluați în tampon de blocare peste noapte la 4 ° C. După ce a fost spălată extensiv cu TBS-T, membrana a fost incubată cu anticorp conjugat cu peroxidază de hrean pentru iepure (Cell Signaling Technology) diluat în tampon de blocare (1: 2000) timp de 1 oră la temperatura camerei .Bandele au fost vizualizate cu Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrat (Pierce) și înregistrate pe filme cu raze X (Fuji Medical, Tokyo, Japonia) În cele din urmă, benzile vizualizate au fost cuantificate prin software-ul QUANTITY ONE pe un densitometru GS-800 Anticorpii, inclusiv anti -Ovoinhibitor (ab193507), anti-Lisozim (ab391) și anti-Avidin (ab6675), au fost achiziționate de la compania Abcam (Cambridge, MA, SUA).

analize statistice

Toate datele au fost analizate folosind analiza unică a varianței (ANOVA), iar mijloacele au fost comparate prin testul Duncan’s multiple range (SAS Institute, 2001). Rezultatele au fost prezentate ca medii ± SEM. Efectele au fost considerate semnificative în tabelul P. (CSM50 sau CSM100) la vârsta de 51 de săptămâni.

Modificări histologice și concentrația hormonului plasmatic

Leziunile histologice nu au fost observate în țesuturile oviductului găinilor la toate grupurile. O creștere deprimată a glandei tubulare și a celulelor epiteliale a fost observată odată cu creșterea suplimentării cu CSM, în special în grupul CSM100 (Fig. 1). Nu a existat nicio diferență semnificativă între nivelurile plasmatice de progesteron și estrogen între grupurile CSM50 și SBM, în timp ce nivelul progesteronului a scăzut semnificativ în grupul CSM100 (P Fig. 1. Oviduct magnum histopatologia găinilor ouătoare alimentate cu diete alimentate cu făină de soia (SBM) și diete care au înlocuit 50% sau 100% conținut de proteine ​​brute din SBM cu făină de semințe de bumbac (CSM50 sau CSM100) la vârsta de 51 de săptămâni.

(Colorarea HE. A, B și C reprezintă grupurile SBM, CSM50 și respectiv CSM100. Mărire A1, B1 și C1 200 ×; mărire A2, B2 și C2 400 ×) G: celulă a glandei tubulare; E: epiteliu.

Celulele glandei tubulare au fost mai mari în grupul SBM decât în ​​grupul CSM100, iar granulele secretoare lângă vârful majorității celulelor epiteliale au fost în general mai mici în grupul CSM100 și conțineau material mai puțin floculant, fie filamentos, fie granular. Mai puține celule ciliate au fost observate și în stratul epitelial din grupul CSM100.

Identificarea, cuantificarea și analiza proteinelor

Cu spectrometrie de masă ridicată, 95 de proteine ​​au fost identificate definitiv din albușul de ou prin 12813 spectre de masă (detalii în tabelul S1). Ambele proteine ​​cu abundență ridicată, inclusiv ovalbumină, ovotransferină, ovomucină, ovoinhibitor, lizosmă, precum și proteine ​​cu abundență scăzută, inclusiv CEPU-Se, tenascină, fibrinogen și di-N-acetilchitobiase etc. au fost detectate în albușul de ou. Între timp, 39 de proteine ​​identificate s-au suprapus comparativ cu rezultatul din cele două studii anterioare [6,7], cum ar fi lizozima găinii, ovomucoida și proteina asociată cu angiopoietina.

Conform etichetelor iTRAQ, 17 proteine ​​exprimate diferențial care s-au modificat de peste 1,2 ori au fost observate între albușul de ou de la găinile hrănite cu dieta CSM100 și cele hrănite cu dieta SBM (Tabelul 3). Combinat cu rezultatele din instrumentele iTRAQ, am obținut un rezultat cantitativ precis de către ioni reporter (Fig 2). Comparativ cu grupul SBM, 15 proteine ​​au fost reglate în jos, în timp ce 2 proteine ​​au fost reglate în sus în grupul CSM100. Pentru a înțelege mai bine proteinele exprimate diferențial între grupurile SBM și CSM100, baza de date Uniprot și Ontologia genică [12] au fost utilizate pentru adnotarea a 17 proteine. Rezultatele au arătat că cele 15 proteine ​​reduse au fost implicate în diverse procese și funcții biologice, cum ar fi activitatea anti-bacteriană sau anti-virus, procesul metabolic, procesul sistemului imunitar, aderența biologică, răspunsul la stimul, reproducerea, reglarea biologică. De exemplu, polipeptida Ig J și precursorul protrombinei joacă un rol important în procesul sistemului imunitar, răspuns la stimul. Precursorul ovomucinei joacă un rol semnificativ în aderența biologică. Ovalbumina și ovomucina sunt importante pentru viscozitatea și proprietatea gelului albușului de ou (Tabelul 3). Cele 2 proteine ​​reglate în sus au fost legate de organizarea componentelor celulare sau biogeneză.

Proteinele au fost analizate în funcție de ionii y și b, cum ar fi y1, y2, y3 și y4 în ovomucină. Datele cantitative au fost calculate din vârfurile obținute pentru ioni reporter care sunt afișate în partea dreaptă.

Exprimarea diferențială a proteinei și validarea prin Western-blot

Pentru a confirma rezultatele iTRAQ, 3 proteine ​​exprimate diferențial; pentru validare s-au ales ovoinhibitorul, lizozima și avidina. Rezultatele arată aceleași modificări ale etichetării iTRAQ (Fig 3).

A, B reprezintă CSM100 și, respectiv, SBM.

Discuţie

Acest studiu a dezvăluit că hrănirea CSM ar putea provoca o scădere a performanțelor de așezare și a calității albuminei. Legătura dintre greutatea oului și greutatea albuminei este mai mare decât cea dintre greutatea oului și greutatea coajei sau gălbenușului [13], iar reducerea greutății ouălor a fost în primul rând asociată cu o reducere a greutății albuminei [14]. Studiul nostru a confirmat că greutatea albuminei a fost, de asemenea, redusă semnificativ în grupul CSM100 comparativ cu grupul martor.

HU se calculează de la înălțimea albuminii groase interioare și în funcție de greutatea ouălor [15]. HU și înălțimea albuminei sunt factori importanți care evaluează calitatea albuminei [16]. HU a fost semnificativ redusă la ouăle găinilor hrănite cu 187 g/kg CSM [17]. Reducerea înălțimii HU și a albuminei în studiul nostru a implicat o scădere a calității albuminei ouălor din grupul CSM100. Rezultatele indică faptul că proteina albă de ou poate fi redusă în dieta CSM100 datorită mecanismelor moleculare care determină o pierdere a calității albuminei.

Clusterina este un tip de chaperonă găsit în fluidele biologice, inclusiv material seminal, urină și plasmă umană. Proteinele desfăcute sau parțial pliate fac ca albusul să-și piardă natura vâscoasă. Clusterina poate duce la interacțiunea și stabilizarea proteinelor desfăcute sau parțial pliate, inhibând precipitarea sau agregarea acestor proteine ​​[25]. Creșterea nivelului de clusterină poate îmbunătăți stabilizarea proteinelor parțial desfăcute, îmbunătățind astfel stabilitatea proteinelor și prelungind durata de depozitare a ouălor. Clusterina a rămas la un nivel stabil la 4 ° C de stocare, dar a dispărut în condiții de stocare la temperatură ridicată, iar calitatea albuminei a fost redusă. S-a sugerat că scăderea clusterinei este un biomarker eficient pentru evaluarea calității ouălor în timpul depozitării la temperaturi ridicate [8]. Studiile anterioare au raportat scăderea calității albuminei, cum ar fi dezvoltarea decolorării albuminei în ouăle depozitate datorită unei diete CSM [4,18,26]. În studiul nostru, nivelurile reduse de clusterină din grupul CSM100 pot oferi dovezi suplimentare că calitatea albuminei în ouăle depozitate este redusă cu găinile ouătoare hrănite cu o dietă CSM.

Cele șase proteine ​​scăzute: ovalbumen, ovotransferrin, ovomucin, lizozim, ovoinhibitor și clusterin, reprezintă aproape 80% din proteinele din albușul de ou și se leagă foarte mult de vâscozitatea albuminei groase [31]. Înălțimea albumei și HU măsoară vâscozitatea albumei de ou [32]. Astfel, aceste proteine ​​reduse din abundență ridicată ar putea juca un rol important în scăderea înălțimii albuminei și a calității albuminei din grupul CSM100, indicând o corelație ridicată între înălțimea albuminei și intensitățile acestora în albușuri de ou. Este interesant de remarcat faptul că patru proteine ​​legate de imunitate, inclusiv regiunea C lanțului Ig mu, polipeptida Ig J, regiunea variabilă a lanțului greu Ig și lanțul greu Ig alfa, au fost identificate ca fiind reduse în grupul CSM100. Aceste proteine ​​cu abundență redusă sunt implicate în răspunsul la stimul, procesul sistemului imunitar și ar putea avea un rol biologic în menținerea integrității albușului de ou, protejând dezvoltarea embrionară timpurie [1].

Studiile anterioare au sugerat că progesteronul și estrogenul sunt legate de sinteza ovalbuminei, ovotransferinei, ovomucoide, lizozimelor și avidinei [33,34]. Nivelurile de progesteron și estrogen din plasmă nu au fost observate în grupul CSM50, dar nivelurile de progesteron au fost semnificativ reduse în grupul CSM100. Progesteronul joacă un rol important în creșterea celulelor epiteliale și a celulelor glandei tubulare ale magnumului [34,35]. La găini, oviductul magnum este în general cunoscut ca locul de formare pentru sinteza proteinelor din ouă. Rezultatele au indicat o creștere mai mică a celulelor epiteliale și a celulelor glandei tubulare în grupul CSM100 comparativ cu grupul martor. Astfel, constatările histologice au fost în concordanță cu datele hormonilor plasmatici, demonstrând că dieta CSM100 ar putea determina o reducere a nivelului plasmatic de progesteron la găini. Această reducere a încetinit în continuare celulele glandei tubulare și creșterea celulelor epiteliale în oviductul magnum în timpul perioadei de hrănire. De asemenea, s-a observat o reducere a sintezei proteinelor din albușul de ou. Cu sute de proteine ​​din albușurile de ouă, este necesară o investigație suplimentară, deoarece puține studii pot fi găsite între tipul celular specific de magnum și proteinele sintetizate [35].

În prezent, există puține cercetări axate pe proteinele din albușul de ou ca urmare a diferitelor tipuri de proteine ​​din dietele găinilor. Modificările moleculare descrise în acest studiu pot explica motivul modificărilor biochimice și pot sugera criterii de selecție mai bune pentru formula pentru hrana puiului pentru a produce nivele de producție mai nutritive.

Concluzii

Acest studiu integrează abordările tradiționale nutriționale, histologice și proteomice pentru a identifica efectele CSM asupra calității albuminei. Dieta CSM100 a avut un efect negativ asupra performanței găinii ouătoare și asupra calității albuminei ouă. Acest studiu a identificat 15 proteine ​​implicate cu diferite funcții biologice, inclusiv activitate antimicrobiană, caracteristici de gelificare, răspunsuri imune, inhibarea precipitării proteinelor, inhibarea proteazei și legarea sau transportul ionilor metalici, care pot juca un rol important în reducerea calității albuminei în grupul CSM100 . Scăderea proteinelor din albușul de ou a fost indusă de creșterea glandei tubulare inferioare și a creșterii celulelor epiteliale ale oviductului magnum atunci când găinile au fost hrănite cu o dietă CSM100. Acest studiu a demonstrat la nivel molecular că SBM nu trebuie înlocuit în totalitate cu CSM în dieta găinilor.

După experiment, găinile rămase au fost hrănite folosind dieta de control în condițiile normale de hrănire, așa cum este descris în partea Metodei.