Institutul de Citologie și Genetică

* V. Naumenko, Laboratorul de Neurogenomică Comportamentală, Institutul de Citologie și Genetică, Divizia Siberiană a Academiei Ruse de Științe, Bulevardul Lavrentyev 10, 630090 Novosibirsk, Rusia. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, divizia siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de biofizică celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de Citologie și Genetică

* V. Naumenko, Laboratorul de Neurogenomică Comportamentală, Institutul de Citologie și Genetică, Divizia Siberiană a Academiei Ruse de Științe, Bulevardul Lavrentyev 10, 630090 Novosibirsk, Rusia. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, divizia siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk

Institutul de Citologie și Genetică

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de biofizică celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Biofizică Celulară, Academia Rusă de Științe, Pușchino, Rusia

Institutul de Citologie și Genetică

Abstract

Hibernarea mamiferelor reprezintă un model unic pentru studiile mecanismelor care reglementează sistemele fiziologice, comportamentul și toleranța naturală la ischemie și hipotermie. Mecanismele creierului care sunt utilizate de hibernatori pentru a face trecerea de la starea normală, eutermică la hibernare caracterizată prin alterarea profundă a temperaturii corpului sunt de un interes deosebit. La veverița de pământ hibernantă, temperatura corpului scade până aproape de mediu, uneori până la 1,5-3 ° C și există o reducere concomitentă (până la 1-5% a ratei euterme) a ritmului cardiac, respirator și metabolic (Barnes 1989; Popova 1986). Creierul unui mamifer hibernant suportă extreme fiziologice care sunt mortale pentru nehibernatori. Identificarea genelor și a mecanismelor neurotransmițătorilor care stau la baza acestui comportament natural de adaptare este primul pas cheie către înțelegerea plasticității creierului și a mecanismului central pentru supraviețuire.

În ultimele decenii, au fost descrise 14 subtipuri diferite de receptori 5 - HT, care au fost împărțite în șapte familii pe baza caracteristicilor operaționale (legate de medicament), transductionale (cuplarea receptorilor) și structurale (secvența primară de aminoacizi). Toți receptorii 5 - HT, cu excepția unuia (tip 5 - HT3), sunt receptori cuplați cu proteine ​​G metabotrope; distinct din punct de vedere structural și funcțional de toate celelalte tipuri de receptori 5 - HT, receptorul 5 - HT3 este receptor de canale ionice cu ligand ionotropic (Barnes & Sharp 1999).

Printre varietatea uimitoare de receptori 5 - HT clonați și identificați, o atenție deosebită s-a concentrat asupra receptorului 5 - HT1A datorită datelor privind implicarea sa în controlul anxietății (Heisler și colab. 1998; Nutt & Glue 1991), somn (Derry și colab. 2006; Wilson și colab. 2005) și hipotermie (Hjorth 1985; Overstreet și colab. 1996), sugerând că receptorul 5 - HT1A poate lua parte la menținerea hipotermiei profunde și a torpelor tipice pentru hibernare. În același timp, nu au existat date cu privire la creierul receptorilor 5 - HT1A în ciclul somn-veghe, precum și nu au existat informații despre gena receptorului 5 - HT1A la hibernatori.

Scopul prezentei lucrări a fost de a investiga expresia genei receptorului 5 - HT1A în creierul veverițelor solare hibernante în diferite etape ale ciclului somn - veghe. Nu au existat date cu privire la secvențele genei receptorului 5 - HT1A în veverița de pământ în bazele de date, astfel încât pentru a determina expresia receptorului, prima etapă a cercetării noastre a fost determinarea secvenței genei receptorului 5 - HT1A în veverița de pământ.

Materiale și metode

Subiecți de animale

Experimentele au fost efectuate pe veverițe de sex masculin (Spermophilus undulatus) cântărind 600-800 g. Animalele au fost prinse în Yakutia la sfârșitul lunii august. În Institutul de Biofizică, Academia Rusă de Științe, Pushchino, veverițele de pământ se aflau sub observație veterinară în vivariul special. Animalele au fost ținute individual în cuști de 35 × 40 × 20 cm, cu acces gratuit la alimente și apă. Lumina a fost aprinsă de la 0700 h la 1900 h. La sfârșitul lunii octombrie, animalele au fost plasate într-o cameră specială, cu o temperatură constantă care se apropia de condițiile naturale (+ 4 ° C). Experimentele au fost efectuate pe patru grupuri de veverițe la sol (10 animale în fiecare grup), decapitate în diferitele etape ale ciclului somn - veghe: (1) în iulie - animale active (temperatura corpului 37 ° C); (2) în octombrie - pregătit pentru hibernare, dar totuși animale euterme (temperatura corpului 37 ° C); (3) în ianuarie - animale hibernante (temperatura corpului 4 ° C) și (4) în aprilie - animale care ies din hibernare (temperatura corpului 28 ° C). Excitația a fost provocată prin transferul animalelor într-o cameră de laborator cu o temperatură ambiantă de 21-22 ° C. Temperatura corpului a fost măsurată în colon cu un termometru electric.

După o decapitare rapidă, creierele au fost îndepărtate pe gheață și apoi au fost izolate cortexul frontal, hipocampul și creierul mediu. Eșantioanele corticale din zonele simetrice ale regiunilor frontale bilateral (Schober 1986), toate hipocampul drept și partea caudală a trunchiului cerebral, inclusiv n. raphe dorsalis și n. raphe medianus (Konig & Klippel 1963), au fost luate. Structurile creierului au fost imediat înghețate în azot lichid și depozitate la -65 ° C până la extracția ARN.

Toate procedurile experimentale au fost realizate în conformitate cu Ghidul pentru conduită etică în îngrijirea și utilizarea animalelor (elaborat de Comitetul pentru cercetare și etică animală, 1991; http://www.apa.org/science/anguide.html).

Transcriptază inversă - reacție în lanț și secvențierea polimerazei

ARN-ul total a fost izolat folosind extracția cu tiocianat de guanidină, fenol și cloroform (Chomczynski & Sacchi 1987) cu modificări (Naumenko și Kulikov 2006). ARN-ul total obținut a fost depozitat în etanol 70% la -20 ° C pentru transfer la Institutul de Citologie și Genetică, Novosibirsk, iar apoi ARN-ul total a fost precipitat, uscat și dizolvat în apă tratată cu dietil pirocarbonat la o concentrație de 0,125 μg/μl și stocat la -65 ° C.

Transcrierea inversă a fost efectuată așa cum s-a descris în altă parte (Naumenko și Kulikov 2006). ADN-ul complementar sintetizat (ADNc) a fost stocat la -20 ° C.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost efectuată folosind primerii direcționați către gena murină a receptorului 5 - HT1A în următoarele condiții: (1) 5 min la 94 ° C, 1 ciclu, (2) 40 secunde la 94 ° C, 40 de secunde la 59 ° C și 40 de secunde la 72 ° C, 36 de cicluri și (3) 4 min la 72 ° C, 1 ciclu (Tabelul 1).

Secvența genei nucleotidelor Temperatura de recoacere (° C) Dimensiunea produsului PCR (bp)
Gena receptorului 5 - HT1A murin F 5 ′ - acttggctcattggctttctcat - 3 ′ 59 602
R 5′‐ ggcagccagcagaggatgaa - 3 ′
β-actină F 5 ′ - cggaaccgctcattgcc - 3 ′ 61 285
R 5 ′ - acccacactgtgcccatcta - 3 ′
Veverițele la sol 5 - gena receptorului HT1A F 5′‐ tactccactttcggcgctttctat - 3 ′ 60 330
R 5′‐ cagtggcaggtgctctttggagtt - 3 ′

  • F, înainte; R, invers. Primerii direcționați către genele receptorilor 5 - HT1A de la șoarece au fost proiectați pe baza secvențelor publicate (Charest și colab. 1993), utilizând baza de date a nucleozidelor din laboratorul european de biologie moleculară, în special pentru estimarea acestei secvențe genice a receptorilor în sol veverițe. Primerii direcționați către gena β-actinei au fost raportați anterior (Zamorano și colab. 1996). Toate grundurile utilizate în această lucrare au fost sintetizate de Biosan (Novosibirsk, Rusia).

Produsele PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 6% (raport acrilamidă/bisacrilamidă = 30: 1) în tampon Tris - acetat. Gelul a fost colorat cu bromură de etidiu. Apoi benzile au corespuns dimensiunii așteptate a produsului PCR al receptorului 5 - HT1A [602 pereche de baze (bp)] au fost decupate. Produsul PCR țintă a fost extras prin eluție pasivă și reamplificat cu 65 pmol atât de primeri direcți, cât și de primari inversi în condițiile date mai sus. Purificarea produselor PCR obținute a fost efectuată prin filtrare pe gel cu rășină superfină Sefadex G-100.

Pentru secvențiere, a fost luată aceeași pereche de exemple folosită anterior pentru PCR. Am amestecat 500 fmol de produs PCR purificat cu 2 pmol de primer direct sau invers corespunzător și 3 μl de amestec ABI Prism® dGTP BigDye ™ versiunea 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și s-a adăugat apă la final volum de 8 μl. Reacția de secvențiere a fost efectuată în Eppendorf MasterCycler (Eppendorf, Hamburg, Germania) cu următoarele condiții: 96 ° C timp de 10 secunde, 96 ° C timp de 8 secunde și 64 ° C timp de 4 min × 3 cicluri, 96 ° C timp de 8 secunde și 60 ° C timp de 4 min × 5 cicluri, 96 ° C timp de 10 secunde, 50 ° C timp de 5 min și 60 ° C timp de 4 min × 19 cicluri, 96 ° C timp de 3 min și depozitare la 4 ° C. Produsele reacției au fost purificate folosind filtrarea pe gel în coloane cu rășină superfină Sefadex G-50.

După purificare, produsele de reacție de secvențiere au fost analizate cu ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) în Centrul Inter-institut de Secvențiere al Diviziei Siberiene a Academiei Ruse de Științe (Novosibirsk, Rusia). Am efectuat analiza genetică moleculară a secvențelor obținute folosind programele F asta v. 3 Nucleotide Database Query (European Bioinformatics Institute) (pentru căutare omologică) și A lign X inclus în V ector NTI S uite versiunea 8.0 (InforMax, Inc., Bethesda, MA, SUA) (pentru alinierea secvențelor). Datele au fost trimise la baza de date GenBank la 21 iunie 2006. Numărul de acces este DQ832326.

Analiza expresiei genei 5 - HT1A

Pe baza acestei secvențe, a fost concepută perechea de grunduire specifică pe genele receptorului 5 - HT1A de veverițe la sol (Tabelul 1). Acești primeri au fost utilizați pentru estimarea expresiei genei receptorului 5 - HT1A în creierul veverițelor solare hibernante în diferite etape ale ciclului somn - veghe.

PCR cantitativă a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Naumenko și Kulikov 2006). ARN-ul mesager (mARN) al β-actinei a servit ca un standard endogen intern, dar în locul ADN-ului genomic, fragmentele de ADNc amplificate au servit ca standarde externe. Acești ampliconi au fost obținuți folosind aceiași primeri care au fost utilizați pentru cuantificarea ARNm a receptorului β-actină și 5-HT1A în mod corespunzător (Tabelul 1). Primerii pentru β-actină au fost utilizați din cauza omologiei acestei gene între mamifere, iar utilizarea standardului extern ne permite să evităm greșelile legate de veverițele de șoarece și de sol β-actina diversitatea genelor.

Produsele PCR au fost rezolvate electroforetic în gel de agaroză 2%. Gelurile au fost colorate cu bromură de etidiu și scanate folosind un sistem Biometra TI3 (Götingen, Germania). Intensitățile fluorescente ale produselor PCR amplificate din ADNc sau standarde externe au fost măsurate folosind imaginea scion v. programul beta 4.0.2. Intensitățile fluorescente ale produselor PCR amplificate de la standarde externe au fost utilizate pentru calibrare; acest lucru a făcut posibilă estimarea numărului de copii pe microlitru de preparat ADNc pentru ADNc-urile receptorului 5-HT1A și al β-actinei. Nivelul expresiei genei receptorului 5 - HT1A a fost normalizat în raport cu 100 de copii ale ADNc-β-actinei.

analize statistice

Tratamentul statistic al datelor a fost efectuat folosind anova unidirecțională, urmată de o comparație post-hoc în conformitate cu testul exact al lui Fisher. Efectele hibernării (animalele active împotriva hibernării) și a regiunii creierului asupra nivelului de ARNm al receptorului 5-HT1A au fost analizate prin măsuri repetate anova. Datele au fost prezentate ca medii ± SEM.

Rezultate

A fost specificată secvența fragmentului de genă al receptorului 5 - HT1A, incluzând al cincilea domeniu transmembranar (79 pb) și a treia buclă intracelulară (385 pb) (Fig. 1). Comparația secvenței de fragment de genă a receptorului 5 - HT1A obținută cu secvențele altor specii prezentate în baza de date GenBank (http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/index.html) a relevat o omologie semnificativă cu receptorii corespunzători 2).

creierul

Veverițe soliene hibernante 5 - secvență de fragment de genă a receptorului HT1A, incluzând al cincilea domeniu transmembranar (subliniat) și a treia buclă intracelulară.

Alinierea secvențelor genetice ale receptorului 5 - HT1A uman, veveriță de sol, șoarece și șobolan. Insertia (GGT) este subliniată și marcată cu caractere aldine. Pozițiile în secvențe diferite de secvența nucleotidică a veveriței de pământ sunt umbrite.

S-a constatat că secvența fragmentului de genă al receptorului 5 - HT1A al veverițelor solare hibernante care codifică al cincilea domeniu transmembranar a arătat 93,6% omologie cu fragmentul analog al genelor șoarecelui și șobolanului și a prezentat 88,5% din omologia cu omul 5 ‐Gena receptorului HT1A. Mai mult, aproximativ 70% din omologie cu secvențele genelor care codifică alți receptori 5 - HT (5-HT1B, 5‐HT7, 5‐HT1D) a fost dezvăluit. În același timp, inserția a trei nucleotide (subliniate și marcate cu caractere aldine în Fig. 2) absente la genele receptorilor 5 - HT1A de șobolan, șoarece și om a fost găsită în zona care codifică a treia buclă intracelulară a veveriței solului 5 - Gena receptorului HT1A.

În ciuda unei scăderi extraordinare a activității animalelor și a temperaturii corpului, nu a existat o depresie semnificativă la nivelul ARNm al receptorului 5 - HT1A în creierul veverițelor solare hibernante, comparativ cu animalele active de varăF1,9 = 4.008, P > 0,05). În același timp, modificări semnificative în expresia genei receptorului 5 - HT1A au fost prezentate în momente critice, cum ar fi intrarea în hibernare și ieșirea din hibernare. A fost dezvăluit impactul substanțial al regiunii creierului asupra răspunsurilor genei receptorului 5 - HT1A (F2,18 = 16,825, P

Benzile de produse PCR hipocampice ale receptorului 5 - HT1A și β - actinei veverițelor macinate în diferitele etape ale ciclului somn - veghe. Benzile de produse PCR ale receptorului 5-HT1A (a) și benzile de produse PCR β-actină (b) de pe gelul de agaroză. 1, hibernare; 2, excitare; 3, prehibernare; 4, activ; 5, standard (450 de copii ale receptorului fragmentului ADNc 5-HT1A în curs de investigare și 36.200 copii ale receptorului fragmentului ADNc-β-actină în curs de investigare).

5 - nivelul ARNm al receptorului HT1A în structurile cerebrale ale veverițelor solare hibernante în diferite etape ale ciclului somn - veghe. Numărul de copii ale ADNc al receptorului 5 - HT1A normalizat față de 100 de exemplare ale ADNc-β-actină. *P

În excitarea de la hibernare, nivelul ARNm al receptorului 5 - HT1A în creierul mediu a scăzut (P

Discuţie

Se atrage atenția asupra creșterii nivelului de ARNm al receptorului 5 - HT1A în timpul perioadei de prehibernare și a excitării din hibernare în hipocamp. Aceste rezultate sunt în acord cu mai multe linii de dovezi electrofiziologice care sugerează că hipocampul ar putea fi un stimulator cardiac pentru inducerea și menținerea stării de hibernare (Sud și colab. 1972). Creșterea semnificativă a expresiei genei receptorului 5 - HT1A în perioada de prehibernare și în excitare din hibernare sugerează puternic o semnificație funcțională a receptorului 5 - HT1A în hipocampus în timpul tranziției atât la hibernare, cât și la starea activă. Semnificația și modul de acțiune al expresiei crescute a genei receptorului 5 - HT1A în hipocampus în intrarea în hibernare și în stimularea animalelor, precum și exprimarea genică destul de ridicată în hibernare nu a fost încă determinată. În același timp, trebuie remarcat faptul că s-a constatat că un aginist al receptorului 5-HT1A repinotan foarte selectiv reduce leziunile ischemice ale creierului, sugerând un efect neuroprotector al receptorilor 5-HT1A (Berends și colab. 2005).

Spre deosebire de hipocamp, s-a arătat o scădere semnificativă a nivelului de ARNm al receptorului 5 - HT1A în creierul central, situsul principal pentru sinteza 5 - HT a creierului în nucleii rafei. Este bine cunoscut faptul că receptorii 5 - HT1A sunt localizați atât presinaptic în nucleii de rafhe din creierul mediu, cât și postsinaptic și, în funcție de localizarea lor, exercită un efect diferit asupra stării funcționale a sistemului 5 - HT. Stimularea receptorilor presinaptici inhibă acest sistem, în timp ce stimularea receptorilor postsinaptici produce efecte tipice activării funcționale a sistemului 5-HT. Se pare că există o diferență de specie în mecanismul predominant pre- sau postsinaptic al hipotermiei induse de 5 - HT1A la șoareci și șobolani (Barnes & Sharp 1999). Nu există date privind raportul receptorului presinaptic/postsinaptic 5 - HT1A la veverițele de la sol. Deci, este destul de dificil să se evalueze semnificația funcțională a reducerii nivelului de ARNm al receptorului 5 - HT1A la animalele care ies din hibernare. Mai devreme, s-a arătat o scădere a activității triptofan hidroxilazei în timpul ieșirii din hibernare în creierul mediu al veveriței solului (Popova și colab. 1993), sugerând că excitarea din hibernare a fost caracterizată de un sistem inactiv 5 - HTergic în unele regiuni ale creierului.

În concluzie, studiile prezente demonstrează, pentru prima dată, similitudinea semnificativă a domeniului transmembranar conservator și diferențele în cea de-a treia buclă intracelulară în gena receptorului 5 - HT1A a veveriței solide hibernante și a nehibernatorilor, șoarecilor, șobolanilor și oamenilor. În viitor, va fi important să înțelegem semnificația funcțională a distincției hibernatorului pentru transducția semnalului receptorului 5 - HT1A și rolul său în strategia unică de supraviețuire a hibernatorului la temperaturi scăzute ale mediului. Descoperirile că supraexprimarea genei receptorului 5 - HT1A din hipocampus precede intrarea în hibernare sunt în conformitate cu rezultatele noastre anterioare, indicând faptul că 5 - HT este implicat în tranziția la hibernare, precum și ideea că hipocampul ar putea fi un stimulator cardiac. pentru inducerea și menținerea stării de hibernare.