Fiziologie acvatică

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Asistență socială și stresori la pește: provocări cu care se confruntă acvacultura Vizualizați toate cele 15 articole

Editat de
José L. Soengas

Universitatea din Vigo, Spania

Revizuite de
Lluis Tort

Universitatea Autonomă din Barcelona, ​​Spania

Saichiro Yokoyama

Universitatea Kagoshima, Japonia

Bernardo Baldisserotto

Universitatea Federală din Santa Maria, Brazilia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

acut

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 CIIMAR - Centrul interdisciplinar pentru investiții marine și ambientale, Universitatea din Porto, Matosinhos, Portugalia
  • 2 MARE - Centrul de Științe ale Marinei și Mediului, ESTM, Instituto Politécnico de Leiria, Peniche, Portugalia
  • 3 Grupul de acvacultură și pescuit, Institutul de Științe Animale Wageningen, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda
  • 4 Laboratorul de fiziologie și genomică din Poissons, Institutul Național de Căutare Agronomică, Rennes, Franța
  • 5 Nutrition Metabolisme Aquaculture (NuMeA) - Institutul Național al Căutării Agronomice (INRA), Saint-Pée-sur-Nivelle, Franța

Introducere

Creșterea peștilor implică respectarea anumitor practici și proceduri care pot include manipularea, nivelurile scăzute ale apei, îngrădirea și aglomerarea (Conte, 2004). Aceste proceduri pot acționa ca factori de stres atunci când obișnuința nu este prezentă (Pickering, 1993; Wendelaar Bonga, 1997; Bratland și colab., 2010; Nilsson și colab., 2012). În plus, condițiile cronice de creștere sub-optimă pot da naștere și la răspunsuri la stres dacă nu este afișată adaptarea completă. Cu toate acestea, informațiile disponibile despre condițiile existente care pot acționa ca factori de stres în timpul creșterii, împreună cu interacțiunile lor, sunt foarte limitate. Acesta este un domeniu de interes tot mai mare, deoarece factorii de stres au fost legați de o reducere atât a performanței de creștere, cât și a stării imune; împiedicarea sănătății și bunăstării la pești (Portz și colab., 2006).

Unul dintre factorii cunoscuți existenți ai stresului la speciile de pești de cultură este concentrația persistentă scăzută de oxigen (hipoxie cronică). Cu toate acestea, consecințele sale sunt încă puțin documentate. În plus, dezechilibrele alimentare pe termen lung afectează homeostazia și echilibrul energetic al peștilor. Inducerea stresului prin dezechilibre alimentare a fost descrisă la pești, inclusiv răspunsuri legate de înlocuirea parțială sau totală a făinii de pește și a uleiului de pește cu surse alternative (Montero și colab., 2003, 2008, 2010; Gómez-Requeni și colab., 2004 ). Studiile anterioare au arătat că performanța de creștere, aportul de furaje și digestibilitatea nutrienților sunt modificate atunci când peștii sunt hrăniți cu diete dezechilibrate electrolitice (Dersjant-Li și colab., 1999, 2000; Saravanan și colab., 2013b; Magnoni și colab., 2016). Cu toate acestea, inducerea stresului prin acest tip de dezechilibru alimentar este încă de investigat la pești.

Echilibrul electrolitic al dietei (DEB) este definit ca suma cationilor minerali minus suma anionilor minerali prezenți în dietă. Diferențele în DEB pot apărea atunci când ingredientele din furaje care conțin cantități diferite de cationi (Na, K, Ca și Mg) și anioni (Cl și P) sunt incluse în formularea dietei (Patience și Wolynetz, 1990). S-a arătat anterior că păstrăvul curcubeu (Oncorhynchus mykiss) au hrănit o dietă dezechilibrată cu electroliți (DEB 700) au fost mai puțin eficienți energetic decât cei hrăniți cu o dietă echilibrată cu electroliți (DEB 200). În ciuda acestei modificări a bilanțului energetic, aportul de furaje și performanța de creștere nu au fost afectate (Magnoni și colab., 2018).

Obiectivul acestui studiu a fost de a determina dacă dieta dezechilibrată a electroliților poate afecta capacitatea păstrăvului de a face față afecțiunilor cronice de hipoxie. Evaluarea impactului fiziologic al factorilor de stres combinați (dietă și hipoxie) a fost analizată la pești înainte și după aplicarea unui factor de stres acut (manipulare/închidere). Această condiție de stres acut este prezentă în mod obișnuit în acvacultură și a fost utilizată pentru a determina capacitatea fiziologică de a face față peștilor.

A fost determinat un set de parametri plasmatici legați de stres și răspunsul imun înnăscut, deoarece sunt asociați în mod obișnuit cu bunăstarea peștilor. În plus, au fost analizați mai mulți parametri în ficat și inimă, deoarece consumul lor de energie este modificat atunci când sunt supuși condițiilor de stres (Wendelaar Bonga, 1997; Hermes-Lima și colab., 2001), inclusiv modificări ale stresului oxidativ și ale răspunsului metabolic. O familie heterozigotă izogenă de păstrăv curcubeu a fost utilizată ca model de pește, datorită uniformității sale genetice, oferind o variabilitate intra-specifică scăzută și o reproductibilitate ridicată.

Materiale și metode

Pești și locuințe

Familia heterozigotă izogenă de păstrăv curcubeu (R23) obținută prin încrucișarea a două linii izogenetice homozigote a fost produsă de instalațiile piscicole experimentale INRA/PEIMA (Franța) (Sadoul și colab., 2015). Peștii au fost adăpostiți în rezervoarele Unității Metabolice Acvatice (AMU) ale grupului de acvacultură și pescuit, Universitatea Wageningen, Olanda. Treizeci de păstrăv curcubeu (115,2 ± 2,0 g) au fost alocați aleatoriu fiecăruia dintre cele douăsprezece tancuri experimentale (200 L). Rezervoarele au fost conectate la un sistem de recirculare a apei format dintr-un filtru de scurgere, o unitate de oxigenare, un bazin, un filtru cu tambur (Hydrotech 500 ®) și un sistem de răcire/încălzire pentru menținerea unei calități uniforme a apei pe tot parcursul studiului. Unitatea de oxigenare a menținut nivelurile de DO prin injectarea de oxigen în apă și a fost facilitată cu sonde automate separate pentru detectarea debitului de apă și a consumului de oxigen. Temperatura apei a fost setată la 14 ± 1 ° C. Fotoperioada a fost menținută la 12:12 (Lumina: Întuneric), cu zorii setate la 07:00 h.

Dietele experimentale și hrănirea

Două diete izoproteice (45% DM) și izoenergetice (22 kJ gDM -1), pelete plutitoare de 4 mm, au fost extrudate de Research Diet Services (Wijk bij Duurstede, Olanda). Dietele, la sosirea la AMU la Universitatea din Wageningen, au fost depozitate într-o cameră în condiții controlate în timpul procesului. Cele două diete au fost formulate pentru a oferi un contrast în conținutul de electroliți (DEB); 200 sau 700 mEq Kg -1. Această diferență a fost creată prin adăugarea diferitelor cantități de Na2CO3 și diamol (umplutură inertă) în diete. Peștii au fost hrăniți cu dietele experimentale până la satisfacție aparentă, de două ori pe zi timp de 49 de zile. Ingredientele și compoziția apropiată a dietelor experimentale sunt incluse în tabelul suplimentar S1.

Condiții experimentale

Proiectare experimentală

Folosind un design 2 × 2 (diete DEB și niveluri DO), tancurile experimentale (12) au fost împărțite în trei blocuri experimentale, cu patru tancuri alocate aleatoriu în fiecare dintre cele trei blocuri (n = 3 rezervoare pe tratament). Peștii nu au fost hrăniți cu o zi înainte de prelevare.

Peștii din fiecare grup experimental au fost împărțiți în 2 subgrupuri pentru aplicarea unui protocol standardizat de manipulare/închidere (stres acut) și eșantionare posterioară. Un subgrup de control în care s-au prelevat trei pești pe rezervor (9 pe tratament) prin reducerea expunerii la potențiali factori de stres. Ulterior, un grup de 3 pești pe rezervor au fost plasați și expuși la un stres de închidere (2 minute la o densitate de 200 kg/m 3) și transferați înapoi în rezervorul lor original (gol) timp de 1 oră. Apoi, peștii din ambele subgrupuri experimentale au fost compensate și eutanasiate pentru prelevare. Un efect de eșantionare a fost prevenit prin eșantionarea rezervoarelor după ce rezervoarele de comandă au fost instalate în încăpere, începând cu subgrupul de control și cu apa din rezervoarele eșantionate în curs de trecere, pentru a preveni reintrarea apei în circulația RAS. O doză letală de soluție de 2-fenoxi-etanol (1 mg/L) a fost utilizată în toate procedurile de prelevare.

Sângele a fost extras din regiunea caudală cu o seringă heparinizată. PH-ul din sânge a fost imediat măsurat (pH-metru, WTW pH 320; electrod pH, WTW SenTix Sp). Durata procedurii (retragerea sângelui și măsurarea pH-ului) a fost strict standardizată la 1 min pentru toți peștii pentru a minimiza variația pH-ului din sânge (Saravanan și colab., 2013b). Sângele a fost centrifugat la 3000 g timp de 20 minute la 4 ° C, iar probele de plasmă au fost congelate și depozitate pentru analize ulterioare. Peștele, ficatul și inima au fost cântărite și prelevate. Probele au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C pentru analize ulterioare.

Conținut de metabolit plasmatic

Concentrația de lactat în plasmă a fost cuantificată utilizând un kit comercial (LO-POD, Spinreatc, Sant Esteve de Bas, Spania). Concentrația de glucoză în plasmă a fost cuantificată folosind un kit comercial (GOD-POD, Spinreatc, Sant Esteve de Bas, Spania). Un kit ELISA bazat pe legătura competitivă dintre cortizol și anticorpii monoclonali înrudiți a fost utilizat pentru a cuantifica nivelurile de cortizol din plasma păstrăvului curcubeu (RE 52061, IBL International, Hamburg, Germania). S-a efectuat validarea trusei pentru determinarea cortizolului în plasma păstrăvului. Coeficientul de variație intra și inter-test în probele de plasmă a fost de 2 valori de 0,96. Rezultatele acestei validări au indicat adecvarea pentru utilizarea acestui kit pentru a cuantifica modificările nivelurilor de cortizol la păstrăvul curcubeu. Toate măsurătorile au fost efectuate în trei exemplare, urmând recomandările furnizate de producători.

Bilanțul energetic în țesuturi

Conținutul total de proteine, glicogen și lipide a fost măsurat spectrofotometric în omogenatele tisulare în conformitate cu De Coen și Janssen (1997, 2003). Țesuturile hepatice și cardiace au fost omogenizate în tampon fosfat (1/10 vol, 0,1 M, pH = 7,4). Proteinele din omogenate au fost precipitate cu adăugarea de acid tricloracetic rece 15% și incubate la -20 ° C timp de 10 minute. După o centrifugare la 1000 g timp de 10 min, supernatantul rezultat a fost utilizat pentru cuantificarea glicogenului prin adăugarea de fenol (5%) și H2SO4 (concentrat). După 30 de minute de incubație la 20 ° C, glucoza a fost cuantificată prin măsurarea absorbanței la 490 nm. Peleta de proteine ​​obținută după precipitarea acidului tricloracetic a fost resuspendată în NaOH (1N), incubată la 60 ° C timp de 30 min și apoi neutralizată cu HCI (1,67 M). Peleta resuspendată a fost utilizată pentru a cuantifica conținutul total de proteine ​​prin metoda Bradford (1976) măsurând absorbanța la 600 nm, folosind ser albumină serică ca standard.

În ceea ce privește extracția lipidelor, cloroformul, metanolul și apa Mili-Q au fost adăugate la omogenate într-o proporție de 2: 2: 1, respectiv. Faza organică a fost separată după centrifugare, tratată cu H2SO4 la 200 ° C și utilizată pentru a cuantifica conținutul total de lipide la 400 nm, folosind ca standard tripalmitina. Conținutul total de proteine, glicogen și lipide din fiecare probă a fost exprimat ca mg pe g de țesut cu greutate umedă. Conținutul total de energie a fost calculat ca suma conținutului de proteine, glicogen și lipide din fiecare țesut, transformat în echivalenți energetici folosind valori pentru entalpia de ardere (24 kJ/g proteine, 17,5 kJ/g carbohidrați și 39,5 kJ/g lipide), așa cum este descris de De Coen și Janssen (1997), și exprimat ca kJ g -1 țesut umed cu greutate umedă.

O alicotă de omogenat a fost centrifugată timp de 5 minute, la 3000 g (4 ° C) și supernatantul a fost utilizat pentru măsurarea activității lactat dehidrogenazei (LDH) și izocitrat dehidrogenazei (IDH). LDH a fost măsurat urmând metoda descrisă de Vassault (1983) și adaptat la microplacă. IDH a fost măsurat urmând metoda descrisă de Ellis și Goldberg (1971) cu adaptările lui Lima și colab. (2007). Pentru normalizarea prin conținut de proteine, metoda Bradford (1976) a fost aplicată pentru a cuantifica proteina în fracția supernatantă, folosind G-globulină bovină ca standard și citind absorbanță la 600 nm. Rata consumului de energie (Ec: măsurată prin sistemul de transport al electronilor -ETS- activitate) a fost efectuată conform procedurii descrise de De Coen și Janssen (1997, 2003). Măsurătorile au fost efectuate la 25 ° C în triplice, utilizând semifabricate de reacție corespunzătoare într-un cititor de microplacă H1 Hybrid Multi-Mode (Biotek ® Instrument, Vermont, Statele Unite).

Markeri de stres oxidativ în ficat

Probele de ficat și inimă au fost omogenizate în tampon fosfat (1/10 vol., 0,1 M pH 7,4). Analizele enzimatice au fost toate efectuate cu amestecurile de reacție și omogenizarea diluării stabilite în testele preliminare. Concentrația de proteine ​​a fost testată la omogenizați utilizând albumina serică bovină ca standard (Bradford, 1976). Peroxidarea lipidelor (LPO) a fost determinată prin cuantificarea prezenței substanțelor reactive formate din acid tiobarbituric (TBARS) (Ohkawa și colab., 1979). Glutation reductaza (GR) (EC1.8.1.7) și glutation peroxidaza (GPx) (EC 1.11.1.9.) Au fost evaluate pe baza oxidării NADPH (Sigma, Portugalia) la 340 nm (Mohandas și colab., 1984; Cribb și colab. ., 1989). Glutationul total (TG) și glutationul oxidat (GSSG) au fost evaluate prin formarea acidului 5-tio-2-nitrobenzoic la 412 nm (Baker și colab., 1990). Glutationul redus (GSH) a fost calculat ca diferență între TG și GSSG. Modificările de absorbție au fost măsurate la 22 ° C într-un spectrofotometru cu microplacă Power-Wave ™ (BioTek Instruments), iar reacțiile au fost efectuate în triplicate. Substratul a fost permis în spațiile de reacție și activitatea de fond a fost scăzută din cea măsurată în prezența substratului.

Parametrii imuni înnăscuti în plasmă

Starea imunitară a fost evaluată prin determinarea parametrilor cheie, și anume lizozima, peroxidaza și activitățile căii alternative a complementului (ACH50). Activitatea lizozimică a fost evaluată conform Lie și colab. (1986), utilizând lizozima de albus de ouă de găină (Sigma, Germania) ca standard și Micrococcus lysodeikticus (0,5 mg mL -1; tampon fosfat de sodiu 0,05 M; pH 6,2) ca suspensie bacteriană. Activitatea peroxidazei (plasma U mL -1) a fost determinată pe baza metodologiei descrise de Quade și Roth (1997). Activitatea ACH50 a fost analizată în conformitate cu Sunyer și Tort (1995) folosind o concentrație de 2,8 × 108 celule mL -1 eritrocite de iepure. Reciprocitatea diluției plasmatice care dă 50% hemoliză a eritrocitelor este egală cu o unitate ACH50.

Măsurători și calcule

Creșterea în greutate (WG) a fost calculată astfel:

unde BWi și BWf sunt greutatea corporală inițială și, respectiv, finală a peștilor din studiu, respectiv.

Aportul de furaje (FI) a fost calculat ca:

unde FITOT este FI total pe rezervor pe perioada experimentală corectată pentru pești morți și furaje neconsumate, n este numărul de pești pe rezervor și t este perioada experimentală (zile).

Furajele neconsumate (pelete) au fost colectate la suprafață la sfârșitul fiecărei perioade de hrănire (1 oră). Peletele rămase pe fundul rezervorului au fost colectate de o unitate de decantare. S-au numărat toate peletele nemâncate și s-a calculat cantitatea prin preluarea și greutatea medie a peletelor în fiecare lot de producție dietetică. Cantitatea de furaje a fost înregistrată zilnic și contabilizată în calculul aportului de furaje. Nu a fost înregistrată nicio mortalitate în timpul studiului, cu excepția unui pește care a alimentat dieta DEB 200 în hipoxie (supraviețuire 98,9%).

Raportul de conversie a fluxului (FCR) a fost calculat astfel:

Rata de creștere specifică (SGR) a fost calculată ca:

Indicele hepato-somatic a fost calculat ca:

Indicele cardio-somatic a fost calculat ca:

Efectele DEB 200 și DEB 700 asupra performanței de creștere și a aportului de furaje ale acestei linii izogene de păstrăv supuse hipoxiei cronice sau normoxiei au fost publicate în Magnoni și colab. (2018). Cu toate acestea, pentru a ajuta la interpretarea rezultatelor prezentate în studiul actual, performanța de creștere și parametrii aportului de hrană au fost incluși ca Tabel suplimentar S2.

Analize statistice

Fiabilitatea markerilor pentru stres acut și cronic

În acest studiu, provocarea alimentară prelungită a crescut nivelul de cortizol în plasmă de păstrăv de 1,23 ori. Cu toate acestea, o astfel de creștere a fost modest comparată cu creșterea de 4,08 ori a nivelurilor plasmatice de cortizol de păstrăv atunci când a fost supus unui factor de stres acut. În ciuda acestor modificări observate, nivelurile de cortizol nu au fost semnificativ diferite la păstrăvul alimentat în diete cu DEB diferit și apoi supus stresului acut (P Cuvinte cheie: păstrăv curcubeu, dezechilibru alimentar, capacitate metabolică, homeostazie a peștilor, hipoxie cronică, factori de stres

Citație: Magnoni LJ, Novais SC, Eding E, Leguen I, Lemos MFL, Ozório ROA, Geurden I, Prunet P și Schrama JW (2019) Stres acut și o dietă dezechilibrată de electroliți, dar nu hipoxie cronică, crește stresul oxidativ și împiedică Statutul imun înnăscut într-o păstrăv curcubeu (Oncorhynchus mykiss) Linia izogenică. Față. Fiziol. 10: 453. doi: 10.3389/fphys.2019.00453

Primit: 15 noiembrie 2018; Acceptat: 01 aprilie 2019;
Publicat: 24 aprilie 2019.

José Luis Soengas, Universitatea din Vigo, Spania

Lluis Tort, Universitatea Autonomă din Barcelona, ​​Spania
Bernardo Baldisserotto, Universitatea Federală Santa Maria, Brazilia
Saichiro Yokoyama, Universitatea Kagoshima, Japonia