Informații despre articol

1 Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.Unitatea de conservare a temperaturii scăzute, National University Medical Institutes, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Block MD 11 # 03-01C, 10 Medical Drive, Singapore 117597. Tel: + 65- 6516-3359; Fax: + 65-6773-5461; E-mail: [email protected] Departamentul de farmacologie, Școala de medicină Yong Loo Lin, Universitatea Națională din Singapore, 10 Medical Drive, Singapore 117597. Tel: + 65-6516-8864; Fax: + 65-6873-7690; E-mail: [e-mail protejat]

celulelor

Abstract

Introducere

Se anticipează că protocoalele de cultură și stocare sterile și fără xeno vor fi o cerință pentru realizarea finală a aplicației clinice a NSPC-urilor. Protocoalele de criostocare sterile și reproductibile ar facilita, de asemenea, cercetarea de bază. Așa cum s-a discutat în domeniile cercetării celulelor stem mezenchimale și embrionare [pentru revizuire vezi (13, 23, 24)], utilizarea derivaților de origine animală și a altor componente organice crește riscul de contaminare și variabilitate de la lot la lot. Având în vedere cerința privind sterilitatea, am demonstrat că crioconservarea materialului biologic prin vitrificare poate fi realizată folosind numai aditivi nonbiologici (17, 19, 22, 32, 38). De asemenea, am dezvoltat un protocol folosind o configurație sigilată „paie în paie” (250 μl paie sterilă așezată în 500 μl paie), care permite menținerea sterilității în timpul crioconservării (18, 19). Protocolul este atât rentabil, cât și în timp, deoarece nu are nevoie de aparate scumpe de răcire lentă și necesită doar imersie directă în azot lichid pentru răcire.

Materiale și metode

Cultura NSPC-urilor

Șoarecii C57BL/6J gravide au fost anesteziați și fetusii embrionari din ziua 14 (E14) au fost extrși chirurgical. Hipocampii au fost disecați și digerați în soluție de tripsină-EDTA 0,25% (Gibco, CA, SUA) timp de 30 de minute cu triturare la fiecare 15 minute.

De două ori volumul de PBS a fost adăugat pentru a opri digestia și țesuturile au fost cernute cu un filtru de celule de 70 μm. Probele au fost centrifugate pentru a peleta celulele, iar celulele au fost apoi placate cu mediu de neurosferă. Mediul neurosferei a constat din DMEM/F12 (Gibco) suplimentat cu supliment N2 (Gibco), 20 ng/ml EGF (Gibco) și 10 ng/ml bFGF (Gibco). După 2-3 săptămâni în cultură au fost prezente neurosfere vizibile și cultura a fost trecută. Pentru trecere, neurosferele au fost lăsate să se așeze într-un tub de microcentrifugă și apoi s-au disociat mecanic folosind o pipetă de 200 μl înainte de a le înlocui în mediu neurosferic proaspăt. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității Naționale din Singapore și au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, National Institutes of Health, SUA.

Vitrificarea neurosferelor

Figura 1. Reprezentarea schematică a procedurilor de vitrificare - încălzire și diluare pentru crioconservarea NSPC-urilor. Concentrațiile totale de solut se referă la soluțiile EG, cu excepția soluției indicate de un asterisc (*), care constă din EG + zaharoză (40% v/v EG și 0,6 M zaharoză).

Încălzirea neurosferelor și diluarea crioprotectorului

Paie care conțin neurosfere au fost încălzite prin imersiune într-o baie de apă la 38 ± 0,5 ° C timp de 30 s cu agitare continuă. Apoi neurosferele au fost despachetate și expulzate în zaharoză 1 M în DMEM/F12 într-un tub de centrifugă de 15 ml. Concentrația zaharozei a fost redusă treptat mai întâi la 0,7 M prin diluare cu zaharoză 0,25 M în DMEM/F12 și ulterior cu 0,175 M după diluarea treptată cu DMEM/F12. Duratele etapelor de încălzire și diluare sunt prezentate schematic în Figura 1. A durat întreaga procedură de diluare

15 minute. Toate tratamentele au fost efectuate la temperatura camerei (23 ± 2 ° C). Neurosferele au fost apoi lăsate să se scufunde. Soluția în exces a fost apoi îndepărtată și neurosferele au fost spălate în mediu de cultură neurosferică înainte de a fi plasate în incubator. După 30 de minute au fost transferați pe medii de cultură proaspete pentru cultura de rutină până la o analiză suplimentară.

Test pentru markeri de celule stem neuronale

Pentru a determina dacă vitrificarea a afectat starea neuronală sau starea celulelor progenitoare, NSPC-urile disociate au fost placate pe diapozitive acoperite cu poli-L-ornitină/fibronectină într-un monostrat și menținute timp de 3 zile în mediu neurosferic. Progenitorul sau celulele stem au fost apoi fixate prin tratament cu paraformaldehidă 4% timp de 20 de minute. Imunomarcarea a fost efectuată secvențial folosind anticorpi anti-Sox2 (AB5603, Chemicon, Tenecula, CA, SUA) și anti-nestin (MAB353, Chemicon) pentru identificarea markerilor neuronali ai celulelor stem sau progenitori. Anticorpii secundari Alexa Fluor conjugați la fluorescență (Invitrogen, CA, SUA) au fost folosiți pentru a vizualiza anticorpii primari și lamelele de acoperire au fost contracolorate cu DAPI în mediul de montare Prolong Antifade Gold (Invitrogen). Celulele imunocolorate au fost apoi imaginate prin scanare secvențială cu un microscop confocal (LSM 510, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Germania).

Testul proliferării celulare

Pentru a testa rata de proliferare celulară a NSPC-urilor, neurosferele martor au fost spălate bine folosind mediu de cultură, înainte de disociere și colorare, imitând procesul de diluare al grupului vitrificat pentru consistența procedurii. Neuroesferele au fost disociate folosind soluție de 0,25% tripsină-EDTA și celulele au fost replatate pe lamele acoperite cu poli-L-ornitină/laminină. Celulele au fost lăsate să adere la lamele de acoperire și 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU; Sigma-Aldrich, MO, SUA) a fost apoi adăugată la mediul de cultură la o concentrație finală de 10 μM și incubată cu NSPC disociate pentru 24 h. Celulele au fost apoi fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 20 min. Imunomarcarea a fost efectuată pentru a detecta încorporarea BrdU utilizând un anticorp anti-BrdU (1: 100, BRD.3, Neomarkers, Lab Vision Corporation, CA, SUA) și a fost detectată folosind anticorpul secundar conjugat Alexa Fluor 555 (Invitrogen). Celulele au fost contracolorate cu DAPI pentru a dezvălui toate nucleele. Celulele au fost imaginate prin scanare secvențială cu un microcop confocal (Fluoview 1000, Olympus, Japonia). Un investigator orb de condițiile de tratament a numărat numărul de celule imunoreactive BrdU și nuclei DAPI-pozitivi, iar numărul de celule BrdU-pozitive a fost exprimat ca procent din numărul total de celule.

Analiza diferențierii multipotente

Analize statistice

Valorile obținute pentru probele vitrificate au fost comparate cu cele ale controalelor de către Student t-test (SPSS versiunea 12, SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). O valoare de p FIG. 2). Pentru a investiga dacă NSPC-urile își vor pierde starea celulelor stem/progenitoare la trecerea în continuare, culturile de neurosfere au fost trecute de trei ori și testul a fost efectuat din nou. După trei pasaje, NSPC-urile au fost încă găsite pentru a exprima nestin și Sox2. Acest lucru indică faptul că starea neuronală sau celula progenitoare a fost menținută pentru cel puțin trei pasaje după vitrificare (Fig. 2B).

Figura 2. NSPC vitrificate mențin expresia markerilor de progenitori sau de celule stem. NSPC-urile vitrificate au fost placate ca monostrat și imun colorate folosind anticorpi anti-nestin (verde) și anti-Sox2 (roșu). NSPC au cultivat (A) după vitrificare și (B) trei pasaje după vitrificare. Toate celulele au fost dublu colorate pentru nestin și Sox2. Exemple reprezentative de celule dublu colorate la mărire mai mare sunt inserate. Bara de scalare: 50 μm.

Efectul vitrificării asupra ratei de proliferare

Rata de proliferare a NSPC-urilor vitrificate a fost comparată cu grupul netratat printr-un test de încorporare BrdU. Rata de proliferare peste 24 de ore a fost calculată ca procent de celule imunoreactive BrdU în numărul total de celule colorate cu DAPI. Vitrificarea nu a modificat semnificativ numărul de celule marcate cu BrdU comparativ cu martorul netratat (Fig. 3B comparativ cu Fig. 3A). Cuantificarea celulelor BrdU-pozitive nu a evidențiat nicio modificare semnificativă a ratei de proliferare în NSPC vitrificate comparativ cu martorul netratat (Fig. 3C).

Figura 3. Testul proliferării celulei BrdU a NSPC-urilor după vitrificare. NSPC-urile disociate de neurosfere (A) netratate și (B) după recuperare după un ciclu complet de vitrificare - încălzire. Celulele disociate au fost placate pe lamele de acoperire acoperite cu poli-L-ornitină și laminină și testate pentru proliferare prin testul de încorporare BrdU. Celulele cu încorporare BrdU au fost identificate folosind un anticorp anti-BrdU (roșu) și lamelele de acoperire au fost contracolorate cu DAPI (albastru). Exemple reprezentative de celule BrdU-pozitive la mărire mai mare sunt inserate. Bare de scară: 80 μm. (C) Numărul de celule supuse divizării în decurs de 24 de ore a fost numărat și exprimat ca procent din numărul total de celule DAPI-pozitive. Datele sunt medii ± SEM din cinci replici. Nu au existat diferențe semnificative.

Diferențierea multipotentă după vitrificare

Neuronii, astrocitele și oligodendrocitele au fost identificate prin imunocolorare cu markeri specifici tipului de celulă (Fig. 4). Atât NSPC-urile netratate, cât și cele vitrificate s-au diferențiat în celule care exprimă fie GFAP, fie MAP2a + b (Fig. 4A și respectiv B) și GFAP sau CNPase (Fig. 4C și respectiv D). Numărul fiecăruia dintre cele trei tipuri de celule a fost cuantificat ca procent din numărul total de celule numărat prin contracolorarea DAPI. Atât NSPC-urile netratate, cât și cele vitrificate au reușit să se diferențieze în 7-11% neuroni, 80-86% astrocite și Fig. 4E). Nu au existat diferențe semnificative în diferențierea celulelor netratate și vitrificate.

Figura 4. Diferențierea multipotentă a neurosferelor. (A) și (C) martor netratat; (B) și (D) NSPC după recuperarea după un ciclu complet de vitrificare-încălzire. Neurosferele au fost diferențiate cu 0,5% ser fetal de vițel și dublu imunocolorat pentru (A) și (B) astrocite și neuroni folosind anticorpi anti-GFAP (verzi) și anti-MAP2a + b (roșii), respectiv (C) și D ) astrocite și oligodendrocite folosind anticorpi anti-GFAP (verzi) și respectiv anti-CNPază (roșii). Nucleii au fost contracolorați cu DAPI (albastru). Bare de scară: 20 μm. (E) Procentul de neuroni, astrocite și oligodendrocite diferențiat de NSPC netratate și vitrificate exprimat ca procent din numărul total de celule DAPI-pozitive. Datele sunt medii ± SEM din trei replici. Nu au existat diferențe semnificative între grupurile netratate și cele vitrificate.

Discuţie

Prezentul studiu a urmărit să investigheze dacă crioconservarea celulelor stem fără utilizarea proteinelor și a serului a fost fezabilă. Mai exact, am stabilit un protocol de vitrificare fără aditivi proteici sau serici pentru crioconservarea sterilă a NSPC-urilor funcționale. Este esențial ca NSPC-urile să își mențină multipotența după crioconservare pentru beneficiul cercetării de bază și pentru aplicarea clinică viitoare. Prin urmare, după ciclul de vitrificare - încălzire, neurosferele au fost testate pentru capacitatea lor de a se diferenția în neuroni, astrocite și oligodendrocite. Toate cele trei tipuri de celule neuronale au fost găsite în NSPC diferențiate după ciclul de vitrificare - încălzire. Nu a existat nicio diferență semnificativă în proporția celor trei tipuri de celule între NSPC-uri netratate și vitrificate. Astfel, aceste rezultate indică faptul că procesul de vitrificare nu afectează diferențierea multipotentă a NSPC-urilor

Exprimarea nestinului și a Sox2, doi markeri neuronali sau celulari progenitori utilizați în mod obișnuit, a fost studiată pentru a se asigura că starea NSPC nu a fost afectată de vitrificare. Ambii markeri au fost detectați în NSPC-uri recuperate de la vitrificare și, de asemenea, trei pasaje după recuperarea de la vitrificare. Acest lucru arată că procedurile de vitrificare nu au modificat expresia acestor importanți markeri de celule stem. În studiul nostru, nu au existat dovezi pentru stimularea diferențierii spontane a NSPC-urilor după recuperarea de la vitrificare, care fusese menționată ca o problemă în urma crioconservării celulelor stem embrionare într-un protocol care implică utilizarea dimetilsulfoxidului (DMSO) (12). Această problemă ar putea fi atribuită rolului DMSO în promovarea diferențierii, a tensiunilor mecanice și osmotice și a altor factori chimici și fizici (2, 9). Menținerea proprietăților progenitorului sau a celulelor stem după vitrificare este probabil să fie importantă în aplicația clinică, deoarece va fi probabil necesară extinderea NSPC pentru a ajunge la numărul de celule dorit pentru terapia de substituție celulară.

Studii recente care s-au îndepărtat de conceptul de „înghețare” cu răcire lentă pentru crioconservarea celulelor stem embrionare nu au evidențiat modificări ale pluripotenței sau anomalii ale cariotipului (28, 29, 31, 39). De asemenea, am efectuat studii pentru a investiga efectele vitrificării asupra stării cromozomiale a ovocitelor umane (15) și a neurosferelor de mamifere (32) și nu am găsit dovezi ale anomalii cromozomiale după vitrificare.

Un dezavantaj major al protocoalelor de crioconservare existente a fost acela că este dificil să se asigure sterilitatea. Agenții patogeni nu numai că pot supraviețui crioconservării, dar, așa cum a arătat experiența în domeniul reproducerii asistate, contaminarea încrucișată poate apărea chiar în timpul criostocării (25, 30, 34). Am inventat o metodă „paie în paie” folosind paie de 250 și 500 μl disponibile ușor, pe care le-am aranjat într-o configurație „paie în paie” (18), ca strategie simplă și rentabilă pentru a preveni contaminare. Această abordare înseamnă că probele pot fi răcite și încălzite prin imersie directă în azot lichid și, respectiv, o baie de apă. Anterior, am inițiat tehnica „paie-în-paie” în crioconservarea embrionilor (15, 16, 18), a sistemelor celulă-matrice (19, 38) și a sferoidilor hepatocitari (22). Împreună cu lucrările noastre anterioare, datele actuale sugerează că această strategie poate fi încorporată într-un protocol eficient de crioconservare pentru NSPC-uri.

Aici am discutat despre un protocol simplu și rentabil pentru crioconservarea neurosferelor prin vitrificare. Deși nu este sigur dacă neurosferele vor fi sistemul de cultură preferat pentru potențialele aplicații clinice viitoare ale NSPC-urilor (11), capacitatea de a păstra structura tridimensională neacceptată a neurosferelor prin vitrificare sugerează că această abordare ar putea fi considerată o metodă de conservare NSPC-uri în structuri tridimensionale microfabricate sau schele (de exemplu, conducte nervoase pentru repararea măduvei spinării) (33). Important, am arătat în prezentul raport că acest protocol nu a afectat proliferarea sau diferențierea NSPC-urilor. Cu evitarea completă a produselor de origine umană sau animală, sperăm că acest protocol poate servi drept punct de plecare pentru dezvoltarea protocoalelor de vitrificare fără proteine ​​și ser pentru crioconservarea celulelor stem umane, în special a celulelor stem neuronale umane care pot în cele din urmă să fie utilizat în medii clinice.

Mulțumiri

Autorii recunosc cu recunoștință sprijinul acordat de Consiliul de cercetare biomedicală din Singapore Dr. Lilia L. Kuleshova (BMRC Grant Nr.: 04/1/21/19/317) și Universitatea Națională din Singapore Premiul pentru tineri investigatori Dr. Gavin S. Dawe. Mulțumim dnei Siew Ping Han pentru sprijinul tehnic și administrativ excelent.