Igor P. Pogribny, Divizia de Toxicologie Biochimică, Centrul Național de Cercetări Toxicologice, Jefferson, AR 72079 (SUA), Tel. +1 870 543 7096, Fax +1 870 543 7720, Email [email protected]

deficitul

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

În lumina acestor considerații, obiectivele acestui studiu au fost: (1) să definească rolul dereglării miARN în stadiile incipiente ale carcinogenezei hepatice și (2) să determine cum aceste modificări ale expresiei miARN pot fi legate mecanic de patogeneza cancer la ficat indus de deficit de metil dietetic.

Materiale și metode

Animale, diete și design experimental

Șoarecii masculi C57BL/6J și DBA/2J (Laboratorul Jackson, Bar Harbor, Me., SUA) au fost adăpostiți în cuști sterilizate într-o cameră cu temperatură controlată (24 ° C) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au primit anunțuri accesul libitum la apa purificată și dieta cu granule NIH-31 (Purina Mills, Richmond, Ind., SUA). La vârsta de 8 săptămâni, șoarecii din fiecare tulpină au fost alocați aleatoriu în 2 grupuri, 1 martor și 1 experimental. Șoarecii din grupul experimental au fost menținuți pe o dietă scăzută cu metionină (0,18%), lipsită de colină și acid folic (Dyets Inc, Bethlehem, Pa., SUA) timp de 12 săptămâni. Șoarecii din grupul de control au primit o dietă suplimentată cu 0,4% metionină, 0,3% bitartrat de colină și 2 mg/kg acid folic. Dietele au fost păstrate la 4 ° C și administrate ad libitum, cu înlocuire de două ori pe săptămână. Cinci șoareci experimentali și 5 șoareci martori au fost sacrificați la 12 săptămâni după inițierea dietei. Ficatele au fost excizate, congelate imediat în azot lichid și depozitate la –80 ° C pentru analize ulterioare. Toate procedurile experimentale pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocolul de studiu pe animale aprobat de Comitetul Centrului Național pentru Cercetări Toxicologice pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor.

Extracția ARN și analiza expresiei microarray miARN

ARN-ul total a fost extras din țesutul hepatic folosind miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, California, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Analiza microarray-ului miARN a fost efectuată de LC Sciences (Houston, Texas, SUA), după cum sa raportat anterior în detaliu [11].

Analiza expresiei miARN prin transcriere inversă cantitativă în timp real PCR

ARN total (200 ng) a fost folosit pentru qRT-PCR-urile miR-29c, miR-34a, miR-122, miR-155, miR-192, miR-200b, miR-203 și miR-221, utilizând teste miRNA TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, California, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. snoRNA202 a fost utilizat ca martor endogen. Cantitatea relativă a fiecărui miARN a fost măsurată folosind metoda 2 –ΔΔCt [12]. Toate reacțiile qRT-PCR au fost efectuate în triplicat și repetate de două ori.

Analiza expresiei genelor prin qRT-PCR

ARN-ul total (10 μg) a fost transcris invers utilizând primeri aleatori și un kit de arhivă de ADNc de mare capacitate (Applied Biosystems), conform protocolului producătorului. Expresia actinei α-musculare netede (α-Sma) gena a fost măsurată prin qRT-PCR, utilizând testul expresiei genei Taqman® (Mm00725412_s1; Applied Biosystems).

Analiza Western Blot a expresiei proteinelor

Nivelurile de ciclină G1 (Ccng1), ciclogenază 2 (Cox2), factor de transcripție E2F 3 (E2f3) și proteine ​​de proteină beta (C/ebp-β) de legare a amplificatorului CCAAT au fost determinate prin analiza imunoblotului Western [13].

Analize statistice

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD. Analizele statistice au fost efectuate de ANOVA cu un singur sens, folosind tratamentul și săptămânile ca factori fixi. Comparațiile perechi au fost efectuate prin testul Student-Newman-Keuls. valorile p