Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Universitatea Jilin, Changchun, China

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Patologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Pediatrie, Spitalul Afiliat al Universității de Medicină Chineză Changchun, Changchun, China

Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Epidemiologie și Biostatistică, Școala de Sănătate Publică, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Hepatologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Corespondenţă

Peng Zhang, Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China.

Dong Li, Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China.

Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Hepatologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Departamentul de patologie, Universitatea din Cambridge, Cambridge, Marea Britanie

Corespondenţă

Peng Zhang, Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China.

Dong Li, Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China.

Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Universitatea Jilin, Changchun, China

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Patologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Pediatrie, Spitalul Afiliat al Universității de Medicină Chineză Changchun, Changchun, China

Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Epidemiologie și Biostatistică, Școala de Sănătate Publică, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Hepatologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Corespondenţă

Peng Zhang, Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China.

Dong Li, Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China.

Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China

Departamentul de Hepatologie, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China

Departamentul de patologie, Universitatea din Cambridge, Cambridge, Marea Britanie

Corespondenţă

Peng Zhang, Departamentul de Chirurgie Toracică, Primul Spital al Universității Jilin, Changchun, China.

Dong Li, Departamentul de Imunologie, Colegiul de Științe Medicale de Bază, Universitatea Jilin, Changchun, China.

Abstract

fundal

Carcinomul pulmonar este încă asociat cu rate ridicate de morbiditate și mortalitate, în ciuda progreselor în terapia cancerului realizate în ultimele decenii. Studii recente au arătat că răspunsurile imune au jucat un rol crucial în dezvoltarea cancerelor, inclusiv a cancerului pulmonar. Răspunsul imun de tip 1 ar putea promova macrofagele clasice activate (CAM) cu proprietăți antitumorale. În schimb, răspunsul imun de tip 2 ar putea duce la polarizarea macrofagelor activate alternativ (AAM) care ar putea promova creșterea și metastaza tumorii. Cercetările noastre anterioare au arătat că deficiența de vitamina A ar putea promova răspunsul imun de tip 2, dar nu răspunsul imun de tip 1. Dacă deficitul de vitamină A are un efect dăunător pentru cancerul pulmonar, trebuie investigat în continuare.

Pentru a investiga efectul deficitului de vitamina A în cancerul pulmonar și mecanismele potențiale.

Metode

Șoarecii au fost hrăniți cu dietă normală sau cu deficit de vitamină A timp de 2 săptămâni, iar apoi, celulele cancerului pulmonar Lewis (LLC) dizolvate în Matrigel Matrix au fost plantate pe partea inferioară stângă a plămânilor. Șoarecii au fost sacrificați la 28 de zile după plantarea celulelor tumorale, s-au măsurat dimensiunea tumorii, profilul citokinei în lichidul de spălare bronhoalveolar (BALF), numărul de celule limfoide înnăscute de tip 2 (ILC2) și fenotipurile de macrofage în plămâni. Rata generală de supraviețuire a fost, de asemenea, monitorizată pe parcursul experimentelor.

Rezultate

Șoarecii purtători de tumori hrăniți cu dietă cu deficit de vitamina A au o rată de supraviețuire mai mică (χ 2 = 6.862, p

Concluzie

Deficitul de vitamina A ar putea promova patogeneza cancerului pulmonar prin inducerea ILC2 și AAM polarizante.

1. INTRODUCERE

Carcinomul pulmonar este încă una dintre principalele cauze de decese în China, în ciuda progreselor înregistrate în ultimele decenii (Chen și colab., 2016). Etiologia exactă a carcinomului pulmonar nu este încă pe deplin înțeleasă, dar în general se credea că este asociată atât cu factori genetici, cât și cu factori de mediu (Cheng și colab., 2012). Studii recente privind interacțiunile sistemului imunitar și ale tumorilor, inclusiv cancerul pulmonar, au arătat că soarta tumorilor sau chiar a gazdei ar fi determinată de sistemul imunitar care s-a infiltrat și a înconjurat tumorile (Joyce & Fearon, 2015; Kitamura, Qian, & Pollard, 2015; Lim și iunie, 2017). Celulele imune pot fie să elimine tumorile, fie să ajute la creșterea tumorii și metastaze care ar putea duce chiar la moartea gazdei. Învierea terapiei imune a tumorii în ultimul deceniu a dovedit că este posibilă tratarea tumorilor prin manipularea sistemului imunitar (Bender, 2017; Couzin - Frankel, 2013). Deși o mulțime de studii actuale s-au concentrat asupra limfocitelor T citotoxice, așa cum s-a făcut cu privire la blocarea PD-1/PDL-1 și CTLA-4 (Pardoll, 2012), există alte celule imune care ar putea regla sistemul imunitar și chiar ucide celulele tumorale direct, cum ar fi cele mai esențiale celule imune, macrofage (Mantovani, Marchesi, Malesci, Laghi și Allavena, 2017).

Macrofagele joacă roluri importante în toate etapele răspunsurilor imune; ar putea iniția, menține sau termina răspunsurile imune (Wynn, Chawla și Pollard, 2013). În mod tradițional, macrofagele ar putea fi catalogate în două subseturi distincte, unul este M1 proinflamator sau activează clasic macrofagele (CAM) care ar putea fi polarizate de citokinele de tip I, cum ar fi IL-12 și INFγ; un altul este antiinflamator, pro-rezoluțional și pro-fibrotic M2 sau activează alternativ macrofagele (AAM) care ar putea fi polarizate de citokinele de tip II precum IL-4, IL-5 și IL-13 (Wynn și colab., 2013; Wynn & Vannella, 2016). Atât CAM-urile, cât și AAM-urile sunt indispensabile pentru menținerea echilibrului sistemului imunitar. Sistemul imunitar are nevoie de CAM-uri pentru proprietățile lor anti-infecție sau antitumorale pentru protecție și de AAM-uri pentru a limita răspunsurile imune pentru a evita deteriorarea autocelulelor (Hume, 2015; Vannella & Wynn, 2017). Macrofagele ar putea juca, de asemenea, rolul de determinare în modelarea răspunsului imun în timpul patogeniei tumorilor. Ele ar putea avea efecte nefaste sau benefice, în funcție de condițiile specifice de polarizare (Murray, 2017). CAM-urile au fost capabile să suprime creșterea tumorilor, totuși AAM-urile au fost raportate că pot promova creșterea și metastaza tumorilor (Mantovani și colab., 2017).

În această lucrare, am stabilit un model de carcinom pulmonar Lewis prin plantarea celulelor LLC direct pe lopul inferior stâng al plămânilor șoarecilor C57/B6. Și am comparat creșterea tumorii și rata de supraviețuire a șoarecilor hrăniți cu dietă cu deficit de vitamină A (VAD) sau dieta de control primită celule LLC sau controale cu gel matricial. De asemenea, măsurăm profilele citokinelor BALF, celulele limfoide înnăscute de tip 2 (ILC2) și macrofagele acestor șoareci pentru a investiga rolul vitaminei A în carcinomul pulmonar.

2 MATERIAL ȘI METODE

2.1 Șoareci

Șoareci C56BL/6 masculi fără patogeni specifici cu greutatea de 20-22 g (achiziționați de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China) au fost găzduiți în condiții specifice de patogeni la Universitatea Jilin, China. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Orientările naționale pentru bunăstarea experimentală a animalelor și cu aprobarea Comitetului de etică pentru bunăstarea animalelor și cercetarea de la Universitatea Jilin (Cui și colab., 2016; Li și colab., 2016).

Dietele cu vitamina A suficientă (TD.10992) și cu deficit de vitamina A (TD.10991) au fost achiziționate de la Harlan Laboratories, Inc., WI, SUA (Cui și colab., 2016; Spencer și colab., 2014). Toți șoarecii au fost menținuți pe dietă specială și apă distilată în autoclavă din ziua sosirii până la sfârșitul experimentelor și toate celelalte proceduri au fost începute cel puțin 14 zile după aceea, respectiv.

2.2 Test imunosorbent legat de enzime

Concentrațiile de citokine din lichidul BAL au fost determinate prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA, eBioscience, Inc., CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorilor descrise anterior (Cui și colab., 2016; Li și colab., 2016; Li, Guabiraba, și colab., 2014; Pushparaj și colab., 2013).

2.3 Modelul carcinomului pulmonar Lewis

Modelul de cancer pulmonar Lewis a fost stabilit așa cum este descris (Bobek și colab., 2010). Pe scurt, celulele LLC au fost cultivate în mediu complet (DMEM cu 10% FBS inactivat termic, 100 U/ml Penicilină, 100 μg/ml Streptomicină, 2 mM L-Glutamină; Sigma-Aldrich, MO, SUA). Culturile au fost incubate la 37,0 ° C într-un incubator umidificat (Thremo Fishher, Germania) suplimentat cu 5% CO2. Celulele viabile au fost numărate cu un hemocitometru Neubauer pe un microscop Nikon Labphot, colorat cu 0,1% (greutate/volum) albastru tripan (Sigma - Aldrich, MO, SUA).

Șoarecii au fost anesteziați prin injecții intraperitoneale (i.p.) cu 150 μl de Avertină (20 mg/ml 2,2,2 - Tribromoetanol, Sigma - Aldrich, MO, SUA). Apoi, plămânii au fost expuși prin deschiderea chirurgicală, tăiată în jurul valorii de 0,5 cm longitudine la nivelul pieptului stâng, 6 × 105 celule LLC suspendate în 20 μl de BD Matrigel (Becton Dickinson, NJ, SUA) sau Matrigel singur (pentru grupurile de control) au fost injectate pe partea stângă inferioară a plămânilor. Rănile chirurgicale au fost cusute cu o sutură. Șoarecii au fost monitorizați îndeaproape până la recuperarea completă din anestezie. Șoarecii au fost sacrificați la 28 de zile după injectarea celulelor LLC de i.p. injectarea a 500 μl de Avertin. Fluidul de lavaj bronhoalveolar (BAL) și țesuturile pulmonare au fost colectate și analizate așa cum s-a descris anterior (Cui și colab., 2016; Li, Guabiraba și colab., 2014). Mărimea tumorii a fost calculată utilizând următoarea formulă, V = 0,5 × L × W 2, unde L și W sunt lungimea și lățimea tumorii (Li, Tian și colab., 2014).

2.4 PCR cantitativă

ARN-ul a fost purificat din probe de țesut folosind RNeasy Mini Kit urmând instrucțiunile producătorului așa cum au fost descrise anterior (Qiagen, Marea Britanie; Cui și colab., 2016; Li, Guabiraba și colab., 2014). Transcrierea inversă (RT) a ARN-ului în ADNc a fost efectuată folosind truse de transcripție inversă a ADNc de mare capacitate (Thermo Fisher Scientific, MA, SUA). Reacția în lanț a polimerazei în timp real (RT - PCR) a fost efectuată utilizând amestecul master SYBR Green Fast pe un Prism 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Primerii utilizați au fost după cum urmează: Il4, înainte 5 ′ - CAT GGC TTG GGT ACA GGT CT - 3 ′, invers 5 ′ - TTT GTA GTG GGA GGG GAC AG - 3 ′; Il5, înainte 5 ′ - GAA GTG TGG CGA GGA GAG AC - 3 ′, invers 5 ′ - GCA CAG TTT TGT GGG GTT TT - 3 ′; Il13, înainte 5 ′ - GAA TCC AGG GCT ACA CAG AAC - 3 ′, invers 5 ′ - AAC ATC ACA CAA GAC CAG ACT C - 3 ′; Ifng, înainte 5 ′ - ACT TTG CTT CTG CCT TTC CA - 3 ′, invers 5 ′ - ACA AGG TCA CCC ACA GGA - 3 ′.

2.5 Scanare tomografică computerizată

Șoarecii au fost păstrați în condiții libere de agenți patogeni timp de 21 de zile după administrarea LLC; dezvoltarea cancerului pulmonar a fost determinată prin utilizarea scanărilor tomografice computerizate (CT). Scanările au fost efectuate cu un scaner CT (SOMATOM Definition AS, Siemens Healthcare GmbH, Germania), așa cum s-a descris anterior. Șoarecii au fost anesteziați și așezați în poziție predispusă pe patul micro-CT fără porți respiratorii. Tensiunea tubului a fost de 120 kV, curentul a fost de 35 mA, iar timpul de expunere a fost de 5 s.

2.6 Citometrie de flux

Leucocitele infiltrate în plămâni au fost analizate prin citometrie în flux așa cum s-a descris anterior (Li, Guabiraba, și colab., 2014). Pe scurt, plămânii au fost recoltați în ziua 14 după administrarea LLC-urilor și digerați în 125 mg/ml Liberase TL și 100 mg/ml DNAse 1 (Roche Diagnostics, Elveția) pentru a caracteriza leucocitele infiltrante. Celulele dispersate (1 × 106 celule pe tub) au fost colorate cu mAbs conjugați cu fluorocrom împotriva CD45 - PerCP, CD11b - APC (toți anticorpii utilizați în citometrie în flux au fost achiziționați de la BD, NJ, SUA. Cu excepția cazului în care se indică altfel), F4/80 ‐FITC (eBioscience, CA, SUA) și CD206 - PE (BioLegend, CA, SUA). Leucocitele au fost colorate cu anticorpi împotriva ST2 - FITC (MD Biosciences, MN, SUA), markeri de linie (CD3, B220, CD11b, CD11c, FcεR1, SIGLEC - F) etichetați cu PE, CD45 - APC și ICOS - PerCP (BioLegend) pentru a caracteriza ILC2-urile infiltrante. Celulele au fost analizate cu un BD carlibr Analyzer (BD). Strategia Gating (Informații de susținere Figura S1) și analiza au fost efectuate cu software-ul FlowJo (FlowJo LLC OR, SUA).

2.7 Analiza statistică

Analiza între grupurile in vivo a fost examinată de Mann-Whitney U test sau ANOVA urmat de Student t testați utilizând software-ul GraphPad Prism (Cui și colab., 2016; Li și colab., 2016; Li, Guabiraba și colab., 2014). Analiza supraviețuirii p valorile au fost calculate folosind testul log - rank (Mantel - Cox). Toate datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM. Valorile p

3. REZULTATE

3.1 Deficitul de vitamina A exacerbează creșterea celulelor tumorale

Studiul nostru anterior a arătat că deficiența de vitamina A (VAD) ar putea spori răspunsul imun de tip II și ar putea agrava progresul bolilor într-un model de șoareci de astm (Cui și colab., 2016). Pentru a investiga dacă s-ar putea observa fenomene similare în tumoră, am hrănit șoarecii cu VAD sau dieta de control timp de două săptămâni înainte de administrarea celulelor tumorale. Șoarecii din grupul VAD au avut o rată de supraviețuire semnificativ mai mică în comparație cu grupul cu dietă normală după ce au primit celule tumorale (χ 2 = 6.862, p

deficitul

3.2 Deficitul de vitamina A a îmbunătățit infiltrarea celulelor imune în plămâni

După stabilirea faptului că hrănirea cu dieta VAD ar putea exacerba cancerul pulmonar la șoareci. În continuare vom investiga modul în care VAD ar putea influența recrutarea celulelor imune în plămâni. BALF a fost recoltat după terminarea șoarecilor și celulele din BALF au fost analizate. Numărul total de celule a fost mărit cu VAD (t = 13,43, p 0,05; t = 2.190, p > 0,05; t = 1.236, p > 0,05; Figura 2b, c, e).

3.3 Deficitul de vitamina A a crescut nivelul citokinelor de tip II din plămâni

După ce sa stabilit că VAD exacerbează creșterea tumorii și infiltrările celulelor imune în plămâni. În continuare verificăm profilele citokinelor din BALF, doar citokinele de tip II, cum ar fi IL-4, IL-5 și IL-13, au fost reglementate în sus de VAD (t = 2.329, p 0,05; Figura 3c). Au fost de asemenea analizate expresiile genetice ale acestor citokine în țesutul pulmonar. Foarte similar cu analizele de proteine, expresiile Il4, Il5, și Il13 (t = 2.543, p 0,05; Figura 3e - h).

3.4 Deficitul de vitamina A a îmbunătățit infiltrarea ILC2 și AAM în plămâni

Apoi, celulele din țesutul pulmonar au fost analizate prin citometrie în flux pentru a investiga modul în care VAD afectează cancerul pulmonar. ILC2 au fost recrutați în plămâni de către VAD (t = 7.680, p 2014). Numărul de macrofage din plămâni a fost, de asemenea, îmbunătățit de VAD (t = 5.294, p

4 DISCUȚII

În acest studiu, am constatat că VAD ar putea crește infiltrațiile ILC2s în plămâni, care ar putea fi legate de producțiile îmbunătățite de citokine de tip II în plămâni, la rândul lor ar putea crește macrofagele activate alternativ în plămâni, ducând în cele din urmă la exacerbarea creșterii tumorale și scăderea ratei de supraviețuire a șoarecilor purtători de tumori.

S-a stabilit bine că interacțiunea dintre celulele tumorale și celulele imune ar putea determina soarta finală a tumorii (Mantovani și colab., 2017). Poate fi eliminat de celulele imune sau ajutat de celulele imune să crească necontrolat sau metastaza către alte organe (Lim & June, 2017). Deși o mulțime de factori se implică în aceste procese, macrofagele, despre care se știa că au funcții pleiotrope, ar putea juca rolul dominant aici (Wynn & Vannella, 2016). Tumora care se infiltrează sau macrofagele înconjurătoare ar putea ucide celulele tumorale direct sau indirect prin recrutarea, activarea și polarizarea altor celule imune sau ar putea ajuta celulele tumorale să scape de alte celule imune, în funcție de ce subseturi au fost polarizate macrofagele (Brune et. al., 2015). Înțelegerea în continuare a modului în care macrofagele au fost polarizate ar putea ajuta la modificarea stării de polarizare a macrofagelor și ar putea ajuta la tratamentul tumorilor.

În concluzie, această lucrare a oferit mai multe informații despre modul în care substanțele nutritive precum vitamina A și RA au remodelat răspunsurile imune. Aceste descoperiri pot oferi o strategie nouă pentru tratamentele cancerului pulmonar.

MULȚUMIRI

Le-am mulțumit în mod special dr. Haizhuo Guo de la a doua parte a primului spital, Universitatea Jilin pentru ajutorul acordat în scanările CT. Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (Nr. 81773412; 81501423), Programul Norman Bethune al Universității Jilin (Nr. 2015223), Fundația pentru Științe Postdoctorale din China, (2018M641787) și Fundația pentru Științe Naturale din provincia Jilin (20190103095JH ). Sursele de finanțare nu au avut niciun rol în proiectarea și desfășurarea studiului; colectarea, gestionarea, analiza și interpretarea datelor; pregătirea, revizuirea sau aprobarea manuscrisului; și decizia de a trimite manuscrisul pentru publicare.

CONFLICTE DE INTERES

Autorii declară că nu au niciun conflict de interese.

REVIZUIRE ETICĂ

Acest studiu a fost realizat în conformitate cu Ghidurile naționale pentru bunăstarea experimentală a animalelor și cu aprobarea Comitetului pentru etica bunăstării și cercetării animalelor de la Universitatea Jilin.

Vă rugăm să rețineți: editorul nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea oricăror informații de susținere furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât conținutul lipsă) ar trebui să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.